郄麗萍，馬 婕，李麗紅，代明偉，張雪霞，任風(fēng)芝

(華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國(guó)家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 052165)

側(cè)孢短芽孢桿菌是既能抗菌、殺蟲又有醫(yī)用價(jià)值的微生物資源，具有多種生物學(xué)活性及廣譜抗菌活性，尤其是對(duì)細(xì)菌和真菌。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道較多的抗菌物質(zhì)有肽類抗生素、非肽類的芽孢菌胺、幾丁質(zhì)酶以及聚酮化合物等[1]。其中抗菌肽是一類具有高效、廣譜抗菌活性的小分子堿性多肽[2-3]，耐熱性、pH值穩(wěn)定性、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性好，具有無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、無(wú)耐藥性等特點(diǎn)[4]。同時(shí)，抗菌肽對(duì)畜禽具有促生長(zhǎng)、保健和治療疾病的功能，在作為無(wú)公害飼料添加劑、藥物等方面具有巨大的潛在應(yīng)用前景。

等離子體誘變技術(shù)是通過(guò)對(duì)細(xì)胞有影響的荷電粒子、光、中性粒子等離子體對(duì)生物遺傳物質(zhì)及表層造成損傷，引起細(xì)胞自我修復(fù)，從而導(dǎo)致生物體基因的改變。等離子體誘變技術(shù)可以較大程度地提高誘變效率，提高細(xì)胞存活率，是一種適合于微生物誘變育種的技術(shù)[5]。

由于實(shí)驗(yàn)室保存的側(cè)孢短芽孢桿菌產(chǎn)抗菌肽菌株發(fā)酵單位偏低，為提高產(chǎn)抗菌肽菌株的產(chǎn)量，作者采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體作為誘變對(duì)象，利用常壓室溫等離子體(ARTP)誘變技術(shù)篩選抗菌肽高產(chǎn)菌株，以降低生產(chǎn)成本，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株、培養(yǎng)基與儀器

側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)KT-06，本實(shí)驗(yàn)室保存。

斜面及固體培養(yǎng)基(LB)：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，瓊脂1.5%～2.0%，pH值調(diào)至7.2～7.4，121 ℃下滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，pH值調(diào)至7.2～7.4，121 ℃下滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，玉米漿0.5%，酵母粉0.5%，CaCl20.15%，ZnCl20.005%，pH值調(diào)至7.2～7.4，121 ℃下滅菌30 min。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.6%，牛肉浸膏0.15%，酵母浸出粉0.6%，葡萄糖0.1%， K2HPO40.2%，KH2PO40.8%，瓊脂1.5%～2.0%，pH值調(diào)至6.0，121 ℃下滅菌20 min。

ARTP-ⅡS型誘變育種儀，無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；LC-2030C型高效液相色譜儀，島津。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

將側(cè)孢短芽孢桿菌KT-06斜面菌種挖塊(0.5 cm×1.0 cm)接種于種子培養(yǎng)基(40 mL/250 mL三角瓶)中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)6～10 h；取2 mL加入6 mL無(wú)菌生理鹽水中，菌懸液濃度達(dá)到107CFU·mL-1。

1.2.2 ARTP誘變[6]

取10 μL菌懸液滴加在無(wú)菌不銹鋼載片上，將載片置于誘變育種儀中，按設(shè)計(jì)時(shí)間進(jìn)行照射；然后將載片投入裝有1.5 mL無(wú)菌生理鹽水的EP管中，振蕩洗滌，混勻，稀釋菌懸液后分離涂布到LB培養(yǎng)基平板上，37 ℃暗培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)。

1.2.3 搖瓶培養(yǎng)

挖塊(0.5 cm×1.0 cm)斜面培養(yǎng)成熟菌種，接種于種子培養(yǎng)基(40 mL/250 mL三角瓶)中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)12～16 h，以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(40 mL/250 mL三角瓶)中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)25～30 h。

1.2.4 發(fā)酵液抑菌活性的測(cè)定

抗菌肽抑菌活性的測(cè)定采用瓊脂擴(kuò)散法。以藤黃八疊菌CMCC 28001為指示菌，用無(wú)菌生理鹽水將其稀釋到107CFU·mL-1。將100 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入直徑195 mm平皿中，冷卻凝固；取0.2 mL指示菌菌懸液置于100 mL冷卻至50～60 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，混勻倒板，冷卻凝固。適當(dāng)位置放置牛津杯，向牛津杯中加入300 μL離心發(fā)酵液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量透明圈直徑(mm)。

1.2.5 發(fā)酵液HPLC分析條件

取發(fā)酵液2 mL，100 ℃ 水浴20 min，13 000 r·min-1離心12 min，取上清液，進(jìn)行HPLC分析。

HPLC條件：C18 柱(4.0 mm×250 mm，5 μm)；A相1‰三氟乙酸，B相純乙腈，梯度洗脫(條件見(jiàn)表1)；檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm，進(jìn)樣溫度35 ℃，進(jìn)樣量15 μL，進(jìn)樣流速1 mL·min-1；tR7.28 min，tC15 min。

表1梯度洗脫條件

Tab.1 Gradient elution condition

2 結(jié)果與討論

2.1 ARTP誘變劑量(處理時(shí)間)的選擇

在LB培養(yǎng)基平板上涂布經(jīng)ARTP誘變處理不同時(shí)間的菌懸液，37 ℃培養(yǎng)3 d，以未誘變處理的菌懸液作為對(duì)照，計(jì)算致死率；搖瓶篩選ARTP誘變處理不同時(shí)間的菌落，計(jì)算突變率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2ARTP處理時(shí)間對(duì)處理效果的影響

Tab.2 Effect of ARTP treatment time on treatment efficiency

ARTP處理時(shí)間/s致死率/%正突變率/%負(fù)突變率/%001.61.93030.65.35.66042.312.013.79075.619.712.912095.38.813.4150100.0--

由表2可知，隨著ARTP誘變處理時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸升高；ARTP誘變處理90 s時(shí)，正突變率最高。因此，確定最佳ARTP誘變處理時(shí)間為90 s。

2.2 突變株搖瓶篩選

采用最佳誘變劑量對(duì)菌懸液進(jìn)行ARTP誘變。第一輪ARTP誘變處理，搖瓶初篩菌株共計(jì)212株，獲得36株發(fā)酵單位提高20%以上菌株；復(fù)篩3批后，獲得高產(chǎn)菌株KT-3-15，比KT-06產(chǎn)量提高25.5%。進(jìn)一步對(duì)菌株KT-3-15進(jìn)行ARTP誘變處理，搖瓶初篩菌株共計(jì)236株，獲得43株發(fā)酵單位提高20%以上菌株；復(fù)篩3批后，獲得高產(chǎn)菌株KT-4-128，比KT-3-15產(chǎn)量提高33.5%，比出發(fā)菌株KT-06產(chǎn)量提高67.5%。

2.3 菌種選育系譜圖

2.4 高產(chǎn)菌傳代穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

菌種傳代穩(wěn)定性是決定菌種能否工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。采用斜面?zhèn)鞔?、搖瓶驗(yàn)證的方法，考察新菌株的傳代穩(wěn)定性。連續(xù)傳代4次，搖瓶驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表3。

表3菌株KT-4-128的傳代穩(wěn)定性/%

Tab.3 Genetic stability of strain KT-4-128/%

由表3可知，連續(xù)傳代4次，相對(duì)發(fā)酵轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定，表明新菌株遺傳特征穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

3 結(jié)論

以抗菌肽產(chǎn)生菌側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)KT-06為出發(fā)菌株，進(jìn)行兩輪ARTP誘變處理，獲得一株具有穩(wěn)定遺傳性的高產(chǎn)菌株KT-4-128，該菌株發(fā)酵水平比出發(fā)菌株提高了67.5%。表明ARTP技術(shù)可有效應(yīng)用于側(cè)孢短芽孢桿菌的誘變選育，可大幅提高抗菌肽的發(fā)酵單位，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。