司曉光，張曉青，杜 瑾，張愛(ài)君，曹軍瑞

(自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

微生物絮凝劑是一類(lèi)由微生物代謝產(chǎn)生的特殊高分子化合物[1-2]，包括多糖類(lèi)、蛋白類(lèi)、脂類(lèi)以及糖脂類(lèi)等，是一種新型的絮凝劑。因其來(lái)源于微生物自身的生理代謝，微生物絮凝劑大多易于降解、安全無(wú)毒、無(wú)二次污染，能滿足綠色生產(chǎn)要求。目前，微生物絮凝劑已經(jīng)成為絮凝劑研究的一個(gè)新熱點(diǎn)，并已在很多領(lǐng)域開(kāi)始了應(yīng)用，如水處理、食品、化工等領(lǐng)域[3-4]。

目前，我國(guó)已從多種環(huán)境中分離出具有絮凝活性的微生物菌種。雖然微生物絮凝劑的相關(guān)研究已經(jīng)進(jìn)行了多年，但仍未取得突破性的研究成果，也未進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，原因主要包括以下3個(gè)方面：(1)微生物絮凝劑本身的穩(wěn)定性差，貯存及運(yùn)輸條件要求較高，影響其絮凝能力；(2)微生物絮凝劑的研究主要集中在菌種篩選和絮凝性能開(kāi)發(fā)上，缺少與實(shí)際應(yīng)用的結(jié)合；(3)與傳統(tǒng)絮凝劑相比，微生物絮凝劑的成本過(guò)高，市場(chǎng)前景堪憂[5-8]。

微生物絮凝劑的開(kāi)發(fā)對(duì)于緩解絮凝劑應(yīng)用中存在的問(wèn)題起到了一定的作用，但還需從降低生產(chǎn)成本、提高穩(wěn)定性等方面進(jìn)行相關(guān)研究，如開(kāi)發(fā)廉價(jià)培養(yǎng)基配方、優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)、開(kāi)發(fā)微生物絮凝劑粉劑等[9-11]。作者以產(chǎn)微生物絮凝劑的芽孢桿菌DHS-63為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行常壓室溫等離子體(ARTP)誘變選育，并進(jìn)行發(fā)酵罐放大試驗(yàn)，擬為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種、培養(yǎng)基與儀器

芽孢桿菌(Bacillussp.)DHS-63，篩選自塘沽入海口的污泥，保存于自然資源部天津海水淡化與綜合利用研究所海水凈化與水再利用技術(shù)研究室。

斜面培養(yǎng)基：酵母粉 5 g·L-1，蛋白胨 10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，2%瓊脂粉，pH值7.0，121 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30.0 g·L-1，尿素5.0 g·L-1，酵母提取物1.0 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 3.0 g·L-1，KH2PO40.8 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.15 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g·L-1，pH值7.0，115 ℃滅菌30 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆油1.0%，豆粕水解液5.0 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 2.5 g·L-1，KH2PO40.6 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g·L-1，pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基：大豆油1.5%，豆粕水解液6.0 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 2.5 g·L-1，KH2PO40.6 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1 g·L-1，pH值7.0，121 ℃滅菌20 min。

ARTP-Ⅱ型誘變系統(tǒng)，北京思清源生物科技有限公司；10 L發(fā)酵罐：上海保興BIOTECH-10BGZ在位滅菌發(fā)酵罐；70 L發(fā)酵罐：NBS BioFlo 610發(fā)酵罐。

1.2 菌種選育方法

1.2.1 菌懸液制備

從斜面培養(yǎng)基挑取1環(huán)活化好的菌種接種到裝有150 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、180 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)20 h，獲得種子液；取種子液，以1%的接種量按照上述方法進(jìn)行培養(yǎng)，6 h后獲得處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子液；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子液1 mL，8 000 r·min-1下離心6 min，棄上清得到菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，重新懸浮于無(wú)菌生理鹽水中，獲得菌懸液。

1.2.2 ARTP誘變

在無(wú)菌條件下，取10 μL菌懸液均勻涂布于不銹鋼載片上，晾干，置于ARTP誘變系統(tǒng)中照射；照射結(jié)束后，將載片置于含有生理鹽水的離心管中，振蕩洗滌，涂布到固體種子培養(yǎng)基平板。ARTP誘變條件見(jiàn)表1。

表1ARTP誘變條件

Tab.1 ARTP mutation conditions

1.3 菌種篩選方法

篩選方法分為初篩和復(fù)篩，詳見(jiàn)文獻(xiàn)[12]。

1.4 10 L分批發(fā)酵

10 L發(fā)酵罐中的裝液量為6 L，轉(zhuǎn)速設(shè)為300 r·min-1，通氣比最大為1.5 vvm，溫度設(shè)為30 ℃，接種量為5%，pH值控制在7.0，發(fā)酵周期為48 h，每隔4 h取樣，測(cè)定發(fā)酵液的絮凝活性和菌體量(OD)，并記錄溶氧、pH值等參數(shù)。

1.5 70 L分批發(fā)酵

70 L發(fā)酵罐中的裝液量為50 L，轉(zhuǎn)速設(shè)為150～300 r·min-1，通氣比范圍為10～30 SLPM，溫度設(shè)為30 ℃，接種量為5%，pH值控制在7.0，發(fā)酵周期為48 h，每隔4 h取樣，測(cè)定發(fā)酵液的絮凝活性和菌體量(OD)，并記錄溶氧、pH值等參數(shù)。

1.6 分析方法

絮凝活性及絮凝劑產(chǎn)量測(cè)定方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 ARTP誘變結(jié)果(圖1)

圖1 芽孢桿菌DHS-63的致死率曲線Fig.1 Lethal rate curve of Bacillus sp.DHS-63

ARTP誘變系統(tǒng)以氦氣(He)為載氣，產(chǎn)生的活性離子能穿透細(xì)胞結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞內(nèi)基因、蛋白質(zhì)等分子造成微生物死亡，而微生物會(huì)啟動(dòng)自身的修復(fù)機(jī)制抵抗這種破壞存活下來(lái)，在此過(guò)程中發(fā)生基因突變。研究發(fā)現(xiàn)，ARTP誘變系統(tǒng)與微生物致死率之間存在著量效關(guān)系，隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，致死率逐漸升高。由圖1可以看出，隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株DHS-63致死率升高。查閱微生物育種的相關(guān)文獻(xiàn)，當(dāng)致死率為90%以上時(shí)，有效突變率最高。因此，選擇150 s作為最佳誘變時(shí)間，此時(shí)的致死率為91.3%。

2.2 突變株篩選及穩(wěn)定性分析

經(jīng)初篩和復(fù)篩，選取絮凝活性提高最大的10株突變株，其絮凝結(jié)果見(jiàn)表2。

表2突變株絮凝結(jié)果

Tab.2 Flocculation results of mutant strain

由表2可以看出，10株突變株的剩余濁度均顯著低于出發(fā)菌株DHS-63的，絮凝活性顯著提高，表明ARTP誘變系統(tǒng)是一種切實(shí)可行的誘變育種方法。

經(jīng)誘變選育出的突變株在傳代過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)遺傳性狀的“衰退”，進(jìn)而影響突變株的遺傳穩(wěn)定性。對(duì)上述10株突變株的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 突變株的遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Genetic stability of mutant strain

由圖2可以看出，突變株在傳代過(guò)程中剩余濁度呈現(xiàn)不同的變化，其中突變株A65、A102、A185、A189、A243和A336的剩余濁度逐漸增加，表明菌株的絮凝活性逐漸降低。經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)選育出的菌株A265則表現(xiàn)出穩(wěn)定的絮凝活性，且較出發(fā)菌株的絮凝活性顯著提高。其中，傳代5代，出發(fā)菌株DHS-63、菌株A265的剩余濁度分別為44 NTU、23 NTU。提取絮凝劑發(fā)現(xiàn)，DHS-63的絮凝劑產(chǎn)量為0.957 g·L-1，而A265的絮凝劑產(chǎn)量為1.08 g·L-1，提高了12.9%。

2.3 10 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵

菌株A265在10 L發(fā)酵罐中發(fā)酵過(guò)程曲線如圖3所示。

由圖3可以看出，0～8 h，菌體含量較少，菌株處于適應(yīng)期；8～28 h，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體含量迅速增加；28 h后處于穩(wěn)定期。發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的剩余濁度逐漸降低，48 h時(shí)達(dá)到最低值，為22 NTU，分離提取獲得絮凝劑10 g，即發(fā)酵液中絮凝劑產(chǎn)量為1.64 g·L-1。

圖3 10 L發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.3 Fermentation process curve of mutant strain A265 in 10 L fermentor

2.4 70 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵

菌株A265在70 L發(fā)酵罐中發(fā)酵過(guò)程曲線如圖4所示。

圖4 70 L發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.4 Fermentation process curve of mutant strain A265 in 70 L fermentor

由圖4可以看出，種子液接入發(fā)酵罐后迅速進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，而絮凝活性則在12 h后進(jìn)入快速升高期。44 h時(shí)，發(fā)酵液的剩余濁度出現(xiàn)最低值，為24 NTU，分離提取獲得絮凝劑80.6 g，即發(fā)酵液中絮凝劑產(chǎn)量為1.55 g·L-1，發(fā)酵時(shí)間縮短了4 h。

2.5 討論

微生物的生長(zhǎng)繁殖以及分泌特定的活性產(chǎn)物都需要一定的條件和適宜的發(fā)酵參數(shù)，發(fā)酵溫度、溶氧、培養(yǎng)基pH值等都會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)狀況和代謝產(chǎn)物的生成。

本研究采用ARTP誘變系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室獲得的一株產(chǎn)絮凝劑菌株DHS-63進(jìn)行誘變，獲得了突變株A265，該突變株的絮凝活性得到了進(jìn)一步提高，而且遺傳性狀穩(wěn)定，是適合工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)良菌株。通過(guò)10 L和70 L發(fā)酵罐試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株A265在發(fā)酵過(guò)程中，菌株生長(zhǎng)到穩(wěn)定期后絮凝活性迅速升高，因此可以認(rèn)為菌株A265產(chǎn)生的絮凝劑為次級(jí)代謝產(chǎn)物。另外，與10 L發(fā)酵罐中發(fā)酵時(shí)間為48 h相比，70 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵時(shí)間僅為44 h，發(fā)酵時(shí)間縮短了4 h。發(fā)酵時(shí)間的縮短有利于降低發(fā)酵成本，并減少發(fā)酵過(guò)程的染菌幾率，對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)具有重要的經(jīng)濟(jì)效益。

3 結(jié)論

利用常壓室溫等離子體誘變絮凝劑產(chǎn)生菌芽孢桿菌DHS-63，通過(guò)篩選和穩(wěn)定性分析獲得了高產(chǎn)菌株A265。與出發(fā)菌株相比，菌株A265的絮凝活性提高了12.9%，且遺傳性狀穩(wěn)定，適合放大生產(chǎn)。經(jīng)10 L和70 L發(fā)酵罐放大試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株A265產(chǎn)生的絮凝劑主要在菌體達(dá)到穩(wěn)定期開(kāi)始，初步認(rèn)定絮凝劑為次級(jí)代謝產(chǎn)物；由10 L擴(kuò)大到70 L發(fā)酵過(guò)程中，絮凝劑產(chǎn)量由1.64 g·L-1下降到1.55 g·L-1，發(fā)酵時(shí)間縮短了4 h，發(fā)酵體積的增加有利于縮短發(fā)酵周期。此研究為大規(guī)模生產(chǎn)微生物絮凝劑提供了參考。