朱震坤 王羽裳 徐欣

山東大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·口腔醫(yī)院種植科 山東省口腔組織再生重點實驗室 山東省口腔生物材料與組織再生工程實驗室，濟(jì)南 250012

熱休克蛋白（heat shock protein，Hsp）是一種在進(jìn)化過程中存在著高度保守性的分子伴侶家族，能夠阻止腫瘤細(xì)胞凋亡，且與其轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[1]。Hsp27是小熱休克蛋白家族的重要一員，在細(xì)胞受到不良刺激時產(chǎn)生，以保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境中自由基、熱、缺血和毒性物質(zhì)等各種應(yīng)激因素導(dǎo)致的損傷，已被證實在細(xì)胞分子信號通路的調(diào)節(jié)，細(xì)胞生長、分化和惡化等方面起著重要作用[2-4]。近年來，有報道[5-9]顯示Hsp27與多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。在課題組前期研究[10]中，成功建立了頭頸部鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移模型，發(fā)現(xiàn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌Hsp27隨其轉(zhuǎn)移潛能的增加，表達(dá)豐度升高。為了進(jìn)一步研究證實Hsp27在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移中的作用，本研究構(gòu)建Hsp27短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）慢病毒載體，轉(zhuǎn)染高轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞UM-SCC-22B，觀察長效沉默Hsp27后其轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為的改變。

1 材料和方法

1.1 材料

Hsp27 shRNA慢病毒載體質(zhì)粒pLKO.1（Open Biosystem公司，美國）；pLKO.1空白對照質(zhì)粒為美國密歇根大學(xué)載體中心自行構(gòu)建并鑒定；病毒顆粒pLenti-shRNA-Hsp27/pLenti-shRNA-ctrl由密歇根大學(xué)載體中心包裝生產(chǎn)。

細(xì)胞系UM-SCC-22B為美國密歇根大學(xué)腫瘤中心Thomas.E.Carey實驗室保存頭頸部鱗狀細(xì)胞癌高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞系，是下咽部原位鱗狀細(xì)胞癌同期淋巴轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞；所有細(xì)胞均于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育。

改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、雙抗（青霉素100 μg·mL-1，鏈霉素100 μg·mL-1）（GIBCO公司，美國）；Trizol試劑（Invitrogen公司，美國），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物合成及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒（Applied Biosystems公司，美國），抗Hsp27/β肌動蛋白單克隆抗體（Cell Signaling Technology公司，美國），二抗（Santa Cruz Biotechnology公司，美國），CellTiter 96?AQueous非放射性細(xì)胞增殖檢測（簡稱MTS細(xì)胞增殖實驗）試劑盒（Sigma公司，美國），Matrigel細(xì)胞侵襲小室（BD BioSciences公司，美國），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（Thermo Scientific公司，美國）。

1.2 體外轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒

1）實驗分組：空白對照使用常規(guī)培養(yǎng)的UMSCC-22B細(xì)胞，記為ctrl組；陰性對照使用UM-SCC-22B細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLenti-shRNA-ctrl慢病毒顆粒，記為shctrl組；UM-SCC-22B細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLenti-shRNA-Hsp27慢病毒顆粒作為shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的實驗組，記為shHsp27組。

2）慢病毒轉(zhuǎn)染方法：將對數(shù)生長期的UM-SCC-22B細(xì)胞接種于100 mm培養(yǎng)皿中，全營養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，40%～60%融合時轉(zhuǎn)導(dǎo)。shHsp27組/shctrl組中分別加入由1 mL 10倍濃度pLenti-shRNA-Hsp27/pLenti-shRNA-ctrl+5mL全營養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基+6 μL聚凝胺（8 μg·mL-1）配制的慢病毒轉(zhuǎn)染體系。

3）各組細(xì)胞37 ℃、5%CO2培養(yǎng)6 h后，更換新鮮全營養(yǎng)培養(yǎng)基，每天換液，24 h后提取總RNA，RT-qPCR檢測Hsp27 mRNA表達(dá)，72 h后傳代。

1.3 RT-qPCR檢測體外轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒后Hsp27 mRNA 的表達(dá)

Trizol試劑分別提取各組細(xì)胞總RNA，溶于無RNA酶水中，紫外分光光度計測定OD260/OD280在1.8～2.0之間。取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。Hsp27引物序列如下：上游，5’-GTCCCTGGATGTCAACCACT-3’；下游，5’-CTTTACTTGGCGGCAGTCTC-3’。β肌動蛋白引物序列為：上游，5’- GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’；下游：5’-CAAAACAATGCTCTGGGTCATCTTCT-3’。RT-qPCR反應(yīng)程序：50 ℃ 2 min；94 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束依據(jù)ΔΔCt法計算相對基因表達(dá)量。

1.4 蛋白質(zhì)印跡檢測體外轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒后Hsp27蛋 白表達(dá)

用蛋白抽提試劑盒分別提取各組總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組蛋白濃度，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白半干轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉20 min，一抗Hsp27/β肌動蛋白單克隆抗體4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，增強化學(xué)發(fā)光（enhanced che miluminescence，ECL）法顯影。

1.5 MTS細(xì)胞增殖實驗

MTS細(xì)胞增殖實驗檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h后細(xì)胞增殖的變化。將對數(shù)生長期的各組細(xì)胞接種于96孔板中，全營養(yǎng)DMEM，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24、48 h，按照100∶1比例，避光加入MTS/PMS混合試劑每孔25 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)2.5 h，BioRad550酶標(biāo)比色儀檢測490 nm處的吸光度，每組設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

1.6 Matrigel體外細(xì)胞侵襲實驗

檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)40 h后細(xì)胞體外侵襲能力的變化。使用無血清1%雙抗DMEM細(xì)胞懸液將各組細(xì)胞接種于自帶凝膠化Matrigel基質(zhì)的上室，下室加入全營養(yǎng)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)40 h后，抹去上室PET膜上表面細(xì)胞及Matrigel凝膠后，置于4 ℃冷室，用-20 ℃保存的甲醇固定10 min，吸棄固定液后，室溫下0.5%結(jié)晶紫染色，雙蒸水洗滌，40倍倒置顯微鏡下拍照，計數(shù)。

1.7 細(xì)胞劃痕實驗

檢測各組劃痕產(chǎn)生0、24、48、72 h后細(xì)胞體外遷移能力的變化。方法如下：于24孔板中接種每孔2×105，每組設(shè)3個復(fù)孔，細(xì)胞長至60%～80%融合時更換1%雙抗無血清培養(yǎng)基，12～18 h后于每孔中央沿直線劃痕，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗2次，更換全營養(yǎng)DMEM，熒光顯微鏡放大40倍拍照，沿細(xì)胞劃痕自上至下取6～8個測量點，測量劃痕寬度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗至少重復(fù)3次，采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)，所有數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05記為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測結(jié)果

RT-qPCR結(jié)果（圖1）顯示，轉(zhuǎn)染pLenti-shRNAHsp27慢病毒顆粒后有效抑制了Hsp27基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染24 h后，shHsp27組中Hsp27 mRNA的表達(dá)量降至ctrl組的（6±0.56）%，高效沉默了Hsp27基因的表達(dá)，兩組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。shctrl組中Hsp27 mRNA表達(dá)量為ctrl組的（81±6.41）%，幾乎不抑制Hsp27基因的表達(dá)。shHsp27組與shctrl組相比顯著沉默了Hsp27基因的表達(dá)（P＜0.01）。

圖 1 RT-qPCR檢測結(jié)果Fig 1 The result of RT-qPCR

2.2 蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果

蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果（圖2）顯示，shHsp27組的Hsp27條帶亮度較ctrl組明顯降低，shctrl組條帶亮度與ctrl組無明顯差異。

圖 2 蛋白印跡檢測結(jié)果Fig 2 The result of Western blot

2.3 MTS細(xì)胞增殖實驗檢測結(jié)果

MTS細(xì)胞增殖實驗檢測結(jié)果（圖3）顯示，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，相同細(xì)胞數(shù)細(xì)胞吸光度值相近，各組細(xì)胞增殖分化能力的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，shctrl組各細(xì)胞數(shù)量的細(xì)胞增殖能力均高于ctrl組和shHsp27組（P＜0.05），shHsp27組在細(xì)胞數(shù)量較高時，增殖能力高于ctrl組。

圖 3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖曲線Fig 3 Proliferation curves of transfected cells

2.4 Matrigel細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果

Matrigel細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果（圖4、5）顯示，ctrl組細(xì)胞侵襲能力為shHsp27組的2.03倍，shHsp27組的侵襲能力顯著降低（P＜0.01），即shRNA沉默Hsp27基因后，細(xì)胞侵襲能力下降。shctrl組的平均細(xì)胞侵襲能力較ctrl組有所下降，shHsp27組與shctrl組相比，侵襲能力顯著降低（P＜0.01）。

圖 4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的侵襲能力 倒置顯微鏡 × 40Fig 4 Invasion of transfected cells inverteal microscope × 40

圖 5 細(xì)胞侵襲實驗穿膜細(xì)胞數(shù)Fig 5 Average cells number of invasion transfected cells

2.5 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果

細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果（圖6、7）顯示，劃痕產(chǎn)生24 h后，shctrl組與shHsp27組無明顯差異（P＞0.05）；劃痕產(chǎn)生48 h后，shctrl組遷移能力有所降低，shHsp27組較shctrl組遷移能力顯著降低（P＜0.01）；劃痕產(chǎn)生72 h后，shHsp27組較shctrl組遷移能力顯著降低更加明顯（P＜0.01）。各時間點shHsp27組較ctrl組細(xì)胞的遷移能力均顯著降低（P＜0.01），劃痕產(chǎn)生72 h后，ctrl組細(xì)胞遷移能力為shHsp27組的4.38倍，即shRNA沉默UM-SCC-22B細(xì)胞Hsp27基因后，其體外遷移能力顯著降低。

3 討論

近年來，隨著環(huán)境污染加劇，吸煙、酗酒等不良生活習(xí)慣等因素的影響，惡性腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌每年約有50萬例新發(fā)患者。盡管隨著醫(yī)療技術(shù)水平的提高和綜合序列治療等方法的運用，早期頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的5年生存率達(dá)到了60%，但是其轉(zhuǎn)移病例的術(shù)后存活時間僅為6個月[11-12]，區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致低存活率的主要因素[13]。在原發(fā)性實體腫瘤中，只有一小部分腫瘤細(xì)胞具備侵襲或轉(zhuǎn)移的能力，高轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞與低轉(zhuǎn)移潛能細(xì)胞之間的基因表達(dá)也不同。因此，如何發(fā)現(xiàn)和確定腫瘤轉(zhuǎn)移亞群的標(biāo)記性基因或蛋白成為研究的熱點。

Hsp27作為一種應(yīng)激蛋白，與多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，其表達(dá)程度與腫瘤分期及預(yù)后有一定的相關(guān)性。有研究發(fā)現(xiàn)，Hsp27在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，如前列腺癌[14]、人肝細(xì)胞肝癌[15-16]、舌鱗狀細(xì)胞癌[17]、胃癌[18]等，被認(rèn)為是預(yù)后不良的標(biāo)志性因子。但仍有諸多研究[19-20]認(rèn)為，Hsp27高表達(dá)預(yù)示著預(yù)后良好。不同組織來源的腫瘤、不同病理分型、不同個體間，Hsp27與腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的關(guān)系不完全一致。

因此，為了最大程度地降低個體差異和不同組織來源所造成的結(jié)果差異，本研究選取了來自同一患者的原發(fā)灶和同期存在的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的2種細(xì)胞系UM-SCC-22A/UM-SCC-22B，并在前期研究[10]中證實了隨著頭頸部鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移潛能的升高，Hsp27的表達(dá)也隨之升高。

為了進(jìn)一步證實Hsp27在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移中的作用，本研究采用了基因工程技術(shù)，將能夠穩(wěn)定表達(dá)Hsp27 shRNA的慢病毒載體轉(zhuǎn)染入高轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細(xì)胞癌UM-SCC-22B細(xì)胞系中，通過體內(nèi)外實驗觀察Hsp27基因與UM-SCC-22B遷移和侵襲能力的關(guān)系。

圖 6 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果比較 電子顯微鏡 × 40Fig 6 Wound-healing assay results of transfected cells electric microscope × 40

圖 7 細(xì)胞劃痕減少百分比的比較Fig 7 Wound width reduced of transfected cells

經(jīng)RT-qPCR和蛋白印跡檢測，高效、特異地沉默了Hsp27基因的表達(dá)，通過MTS細(xì)胞增殖實驗、細(xì)胞劃痕實驗、Matrigel細(xì)胞侵襲實驗，證實了長效轉(zhuǎn)染shRNA Hsp27慢病毒后，UM-SCC-22B的體外轉(zhuǎn)移能力明顯下降。其中，MTS細(xì)胞增殖實驗發(fā)現(xiàn)，shctrl組的增殖能力增強，目前雖無理論依據(jù)揭示其原因，但此現(xiàn)象揭示了細(xì)胞劃痕實驗和Matrigel細(xì)胞侵襲實驗的差異性結(jié)果并非由細(xì)胞增殖能力差異引起，而shHsp27組細(xì)胞增殖能力增強的同時侵襲和遷移能力降低，更進(jìn)一步說明沉默Hsp27基因后，有效抑制了UM-SCC-22B的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，長效轉(zhuǎn)染慢病毒顆粒pLenti-shRNA-Hsp27能夠高效、特異地沉默高轉(zhuǎn)移潛能頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系UM-SCC-22B的Hsp27基因的表達(dá)，并能顯著抑制其體外侵襲轉(zhuǎn)移能力。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。