程俊鑫 白賀天 常治楠 李敬 陳謙明

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，成都 610041

口腔癌是全球十大常見癌癥之一，組織結(jié)構(gòu)上約90%屬于口腔鱗狀細胞癌（oral squamouscell carcinoma，OSCC）[1]。近年來其發(fā)病率不斷上升，據(jù)全球癌癥預(yù)估數(shù)據(jù)[2]顯示，在2018年將會有246 420例口腔癌男性新發(fā)患者，108 444例口腔癌女性新發(fā)患者。根據(jù)世界衛(wèi)生組織頭頸部腫瘤分類第4版[3]中介紹，口腔黏膜癌前病變主要包括口腔潛在惡性疾?。╫ral potentially malignant disorder，OPMD）[4]、口腔上皮發(fā)育不良（oral epithelial dysplasia，OED）和增殖性疣狀白斑（proliferative verrucous leukoplakia，PVL），而其中常見的口腔黏膜癌前病變則包括口腔黏膜白斑?。╫ral leukoplakia，OLK）[5]、口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）[6]、口腔黏膜紅斑?。╫ral erythroplakia，OE）[7]、口腔黏膜下纖維性病變（oral submucous fibrosis，OSF）[8]、盤狀紅斑狼瘡（discoid lupus erythematosus，DLE）[9]、口腔慢性念珠菌病[10]和光化性唇炎[11]等。目前，雖然外科手術(shù)治療、放射治療、輔助化學(xué)治療等治療方式都有較大發(fā)展，但OSCC的5年生存率仍沒有明顯提高，僅為50%，低于許多其他實體腫瘤。OSCC發(fā)生發(fā)展的分子機制尚不清楚，臨床上也缺乏能對其進行早期診斷和預(yù)后判斷的特異性分子標(biāo)志物。為深入研究口腔黏膜癌前病變及癌變機制，進而尋求有效的防治手段和針對性的治療措施，構(gòu)建有效的口腔黏膜癌前病變及口腔癌動物模型就成為了相關(guān)研究的重要突破口。

1 口腔黏膜癌前病變動物模型

目前常見的口腔黏膜癌前動物模型分類有以下3種：誘導(dǎo)性動物模型、移植瘤動物模型和基因修飾動物模型。但部分常見口腔黏膜癌前疾病包括OE、DLE以及光化性唇炎均尚無有效的動物模型，本部分將詳細介紹OLK、OLP、口腔慢性念珠菌病和OSF這4種疾病的動物模型。

1.1 OLK動物模型

根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的第11版國際疾病分類標(biāo)準(zhǔn)[12]，OLK是一種發(fā)生在口腔黏膜上的白色斑塊或斑片，其周圍附著有上皮增生、過度角化的疾病。建立OLK的動物模型的方法主要有2種：化學(xué)誘導(dǎo)法和原位移植動物模型。

1.1.1 化學(xué)誘導(dǎo)法 化學(xué)誘導(dǎo)法方面，有研究者[13]采用0.005 g·L-1的苯并芘（Benzo[a]pyrene，BaP）/7，12-二甲基苯并蒽（7,12-dimethyl-benz[a]anthracene，DMBA）聯(lián)合誘變劑對5周齡地鼠的頰囊黏膜進行涂擦，分別持續(xù)15周，每周3次，建立了OLK動物模型。雖然化學(xué)誘導(dǎo)法建立金黃地鼠頰囊OLK動物模型十分簡便快捷，但是人類沒有頰囊這一結(jié)構(gòu)，而且人類的口腔黏膜也比金黃地鼠頰囊要厚，所以學(xué)術(shù)界一直對該模型有效性有爭論。同時DMBA處理容易破壞黏膜上皮層。

后有研究者[14]改用4-硝基喹啉-N-氧化物（4- nitroquinoline N-oxide，4NQO）飲藥法處理小鼠，取0.001 g·L-1的4NQO用飲藥處理周齡6周的小鼠，分別持續(xù)24周，每周3次，可建立OLK動物模型。成年小鼠口腔黏膜與人非常相似，所以能夠解決口腔黏膜的差異性問題。然而這一模型有建模周期較長，將飲藥處理法改為涂藥法，產(chǎn)生相同病理結(jié)果的時間要短3～4周。有研究者[14]取0.005 g·L-1的4NQO用涂藥法，涂抹周齡6周小鼠的舌部，分別持續(xù)20周，每周3次，可建立OLK動物模型。

除此之外，還有學(xué)者[15]使用化學(xué)誘導(dǎo)法與機械刺激相結(jié)合：采用慢性機械刺激及50%香煙煙絲丙酮提取液涂擦已經(jīng)用拔髓針輕刮多次的8周齡小鼠舌左側(cè)緣中后1/3偏腹側(cè)及左頰部中份黏膜處，至出現(xiàn)小的出血點或者發(fā)紅，持續(xù)15～25周，可建立OLK動物模型。

1.1.2 原位移植法 在原位移植動物模型方面，有研究者[16]向5～8周齡的嚴重聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠的舌腹部移植人非白色念珠菌感染的OLK病損組織，可以建立OLK的動物模型。

在上述的這些動物模型中，尚不能完全地模擬人類OLK的生物學(xué)特性，各有各的優(yōu)缺點（表1），對OLK的研究目的、研究手段不同，選用的動物模型也就不同，如何建立有效、穩(wěn)定的OLK動物模型仍有待進一步探索，通過轉(zhuǎn)基因法來構(gòu)建OLK變動物模型，可能是今后的研究方向之一。

表 1 OLK動物模型比較Tab 1 Comparison of OLK animal model

1.2 OLP動物模型

OLP是一種細胞免疫紊亂造成的自身免疫病，世界衛(wèi)生組織將其定義為癌前狀態(tài)，其常見臨床表現(xiàn)是網(wǎng)狀、環(huán)形或者斑片狀的白色丘疹[17]。目前OLP發(fā)病機制尚不明確，可能和抗原特異性以及抗原非特異性的T細胞介導(dǎo)的慢性炎癥組織反應(yīng)相關(guān)，也受包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等基因多態(tài)性、壓力、煙草刺激等因素影響[18]。目前大部分建模方式均效果不佳（表2），但仍可嘗試通過對具有遺傳特性的棕色挪威鼠皮下注射氯化汞溶液，后向其黏膜表面涂抹氯化汞溶液從而構(gòu)建OLP動物模型[19]。

未成功的建模方式主要包括：移植OLP患者病損組織至小鼠舌腹及背部[20]或皮膚[21]進行培養(yǎng)，也可通過黏膜表皮或皮膚針刺劃痕法進行模型構(gòu)建[22]，但幾周后都出現(xiàn)了病理特征消失的現(xiàn)象?？赡艿慕忉屖荗LP的發(fā)生和宿主的自身特性相關(guān)，或因為建模過程中由于患者病損組織淋巴細胞游走或被小鼠自然殺傷（natural killer，NK）細胞所殺傷。

表 2 OLP建模的比較Tab 2 Comparison of OLP animal model

1.3 口腔慢性念珠菌病動物模型

念珠菌是一種感染口腔和陰道黏膜表層的常見條件致病真菌，口腔念珠菌病的發(fā)生和發(fā)展受局部和系統(tǒng)的多種因素影響[23]。目前明確說明所建立模型為口腔慢性念珠菌感染動物模型的報道較少，而對于口腔念珠菌感染的方法報道則較為全面，因此本部分主要介紹口腔念珠菌感染的方法，其中包括消化道感染、靜脈接種、口腔潰瘍并灌注口腔念珠菌，運用激素以及基因型的篩選為口腔慢性念珠菌動物模型的建立提供參考。

1.3.1 靜脈注射法 對免疫缺陷小鼠每天連續(xù)注射環(huán)磷酰胺，3 d后通過小鼠口腔感染白色鏈球菌即可形成口腔的局限性感染而建立動物模型[24]。也有研究者[25]先使得小鼠發(fā)生口腔潰瘍后再進行口腔念珠菌灌注，向昆明小鼠口腔內(nèi)注射環(huán)磷酞胺溶液后，用醋酸溶液灌口腔，2 h后再用念珠菌菌懸液0.5 mL灌注口腔，也可建立口腔念珠菌感染物模型。除此還可以采用潑尼松龍構(gòu)建相應(yīng)動物模型，有研究者[26]對小鼠注射苯甲酸雌二醇后，注射潑尼松龍進行處理，后將含100 μL菌液的棉球塞入小鼠口腔1～2 h，可建立口腔念珠菌感染動物模型。還有研究者[27]將白色念珠菌涂抹在大鼠口腔黏膜并每周用無菌探針輕刮3次，持續(xù)數(shù)周，可成功構(gòu)建動物模型；而如果在實驗前在大鼠飲水中添加阿莫西林進行預(yù)處理，則白色念球菌感染效果更好。

1.3.2 利用基因型篩選法 Hu等[28]通過對6周齡的BALB/c（敏感型）小鼠進行白色念球菌3683注射，發(fā)現(xiàn)其動物模型的白色念球菌感染比CBA/CaH（抵抗型）小鼠更為嚴重；并且白色念球菌3683比白色念球菌3630型和SC5314型口腔感染更好。

目前盡管已經(jīng)有許多成熟的口腔念珠菌感染動物模型，但由于人類口腔慢性念珠菌病的發(fā)生十分復(fù)雜，相關(guān)機制尚不完全明確，對于口腔慢性念珠菌動物模型建立的較少，同時很多的動物模型一般只能模擬部分口腔慢性念珠病發(fā)生的特征。研究者從原先的靜脈感染到后來的結(jié)合宿主自身免疫狀態(tài)和感染方式，以及對動物模型的選取采取了基因?qū)用娴姆治觯l(fā)現(xiàn)變化的基因種類繁多，同時不同基因型小鼠的動物模型成功率有明顯差異。因此，從動物模型的本身基因型進行篩選可能是一種更有前景的動物模型制作方向，而口腔慢性念珠菌病動物模型的有效建立仍有待進一步探索。

1.4 OSF動物模型

OSF是一種口腔癌前病變，其黏膜上皮萎縮、玻璃樣病變，主要臨床表現(xiàn)為感覺口腔干燥，灼痛，進食刺激性食物時感到疼痛，嚴重者可致張口和進食困難。

Sumeth Perera等[29]曾采用檳榔提取物滴小鼠口腔黏膜，建模成功，但建模時間長達300～600 d，時間太長。有文獻[30]報道在8周時間內(nèi)，在麻醉狀態(tài)下，每天向SD大鼠兩側(cè)頰黏膜下注射1 g·L-1的博來霉素稀釋液，可制備出實驗性O(shè)SF大鼠模型。博來霉素是治療惡性腫瘤效果較好的重要化療藥物，但其主要不良反應(yīng)為肺纖維化，也正是因為該藥物的這種不良反應(yīng)，博來霉素成為了構(gòu)建肺纖維化模型的金標(biāo)準(zhǔn)[31]。實驗者也嘗試利用博來霉素的不良反應(yīng)效果構(gòu)建OSF，在他們的建模過程中，第2周即在實驗組口腔黏膜發(fā)現(xiàn)了巨噬細胞等炎性細胞浸潤，而在這過程中，巨噬細胞可能分泌了轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1導(dǎo)致成纖維細胞（fibroblast，F(xiàn)B）向肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）的轉(zhuǎn)變[32]，并在第4周時發(fā)現(xiàn)了動物模型中干擾素（interferon，IFN）-γ表達的下降，這可導(dǎo)致其拮抗TGF-β1的能力下降[33]，進而促進OSF的發(fā)生。

目前沒有公認的重復(fù)性較好的OSF動物模型，相比較來看，博來霉素所誘導(dǎo)的動物模型效果較好，同時OSF也是由于長期咀嚼檳榔刺激而產(chǎn)生的，還需要對相關(guān)動物模型的實驗條件、高敏動物種屬等進行進一步的摸索與選擇。

2 口腔癌相關(guān)動物模型

口腔癌是十大癌癥之一，預(yù)估在2018年，全球?qū)谐^30萬的新發(fā)口腔癌患者[2]，口腔癌中90%為OSCC，口腔癌大多是由口腔黏膜癌前病變發(fā)展而來的。在我國，口腔癌發(fā)病率較高，因其解剖位置特別、累及面廣，危害較大，其5年生存率不足50%，亟待提高診治水平，因此口腔癌動物模型的構(gòu)建十分重要。常見的口腔癌動物模型建立方法包括：化學(xué)誘導(dǎo)法、原位移植法和轉(zhuǎn)基因法。

2.1 化學(xué)誘導(dǎo)法

化學(xué)誘導(dǎo)法是目前最為成熟的口腔癌模型建立方法，成本低、發(fā)生條件易控制、可大規(guī)模批量建立，深受科研工作者的青睞。

化學(xué)誘導(dǎo)法最為常用的2種化學(xué)藥物為9,10二甲基-1,2苯并蒽以及4NQO。9,10二甲基-1,2苯并蒽中存在苯環(huán)結(jié)構(gòu)，有直接致癌作用，常用液體石蠟或丙酮溶解進行使用，但9,10二甲基-1,2苯并蒽容易破壞上皮細胞DNA的正常架構(gòu)。4NQO是一種水溶性的致癌物質(zhì)，經(jīng)口服可誘導(dǎo)口腔癌[34]，其代謝產(chǎn)物有導(dǎo)致鼠7號染色體突變的致癌作用[35]。

Nagini等[36]利用9,10二甲基-1,2苯并蒽的石蠟油溶液涂抹小鼠頰囊，持續(xù)14周，成功建立了OSCC動物模型。有學(xué)者[37]對大鼠黏膜用4NQO水溶液進行涂抹，持續(xù)28周后成功誘導(dǎo)出浸潤性O(shè)SCC。飲水法也是4NQO常用誘導(dǎo)方法之一，一些學(xué)者[38]用4NQO喂養(yǎng)SD大鼠32周，也可成功構(gòu)建口腔癌動物模型。隨后有研究者[39]結(jié)合基因敲除手段，發(fā)現(xiàn)視黃醇基因敲除小鼠被4NQO誘導(dǎo)成功的時間縮短。Lin等[40]連續(xù)8周用9,10二甲基-1,2苯并蒽涂抹小鼠頰囊，后連續(xù)4周繼續(xù)使用水解檳榔堿，最后成功建立OSCC動物模型，大幅減少了DMBA單獨使用時的建模時間。

2.2 原位移植法

原位移植瘤模型是目前運用較為廣泛的一類口腔癌誘導(dǎo)方法，除口腔癌之外也運用到全身組織器官的腫瘤模型建立中，開辟了在人體外建立人類腫瘤模型的途徑。按照接種的形式可以分為活體腫瘤細胞株接種（cell line-derived xenograft，CDX）模型（即細胞源性異種移植模型）和腫瘤組織塊移植（patient-derived xenograft，PDX）模型（即人源腫瘤異種移植模型）[41]。按照接種的腫瘤來源可分為小鼠來源的腫瘤細胞和人源性腫瘤細胞，適用的實驗對象分別為小鼠和裸鼠。按照移植的部位可分為皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型。皮下移植瘤模型就是將瘤組織或細胞用注射器注入動物皮下（常為背部、腹股溝、前肢腋窩等處），因皮下血供較差、纖維結(jié)締組織豐富，腫瘤多為局限性生長且位置表淺，容易觀察[42]。而口腔癌模型原位移植法則是將瘤細胞或組織移植到口腔內(nèi)相應(yīng)部位，讓腫瘤在其原發(fā)部位生長，并具有向周圍侵襲擴散的能力，這樣能客觀地反映口腔癌的生物學(xué)行為，吻合“種子與土壤理論”，能模擬出腫瘤細胞與宿主組織器官間相互作用的關(guān)系[42]。

裸鼠在口腔癌動物模型的建立中是至關(guān)重要的實驗動物，是一種由第11對染色體的nu/nu基因純合雜交而形成的新品種無毛小鼠。由于胸腺先天性缺失，其特征表現(xiàn)為缺乏T細胞免疫產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)，在一定程度上可接受外來的移植細胞，因此廣泛地運用到了移植法誘導(dǎo)口腔癌動物模型中[43]。另外，由于金黃地鼠的口腔兩側(cè)有頰囊結(jié)構(gòu)，在此區(qū)域內(nèi)缺乏組織相容性抗原，可避免對移植組織的免疫排斥反應(yīng)，其可用于移植法建立口腔癌模型[44-46]。近年來，新西蘭大白兔也常被作為實驗建模對象，相比于鼠科動物來說，其優(yōu)點在于體積較大，便于影像學(xué)檢測、抗癌藥物篩選及介入治療等相關(guān)研究項目的開展[47]。

Cal-27、HSC-3和SCC Ⅶ細胞系屬于較為經(jīng)典的用于OSCC腫瘤模型構(gòu)建的細胞系。而近年來VX2細胞株的誘導(dǎo)潛力被逐漸發(fā)掘，其具有誘導(dǎo)時間短、侵襲性強、成功率高的特點，并在生物學(xué)行為上與人OSCC較為相似[45]。Jefferis等[48]首先報道了用VX2細胞株構(gòu)建兔舌鱗癌的實驗，取得了較好的結(jié)果。

綜上，原位移植法能較好地保留人類口腔癌的部分特性，在原位移植中可觀察到腫瘤擴散浸潤的生物學(xué)行為，能在一定程度上擬合人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。但移植法需具備一定的外科手術(shù)條件，確保嚴格無菌，以防實驗動物出現(xiàn)術(shù)后感染、傷口黏連等情況，這也增加了動物模型建立的難度。

2.3 轉(zhuǎn)基因法

轉(zhuǎn)基因法是20世紀90年代新興的一種構(gòu)建口腔癌動物模型的方法，它通過基因工程技術(shù)使目的基因整合于受體染色體，形成可將目的基因在后代中穩(wěn)定傳遞的個體，使受體生物及其家族均表現(xiàn)出研究者所需要的口腔癌性狀。2005年Opitz等[49]率先建立了第一個口腔癌轉(zhuǎn)基因動物模型，他們將目的基因注入受精卵的雄原核，得到C57BL/6鼠，并將其回交3代得到的較純轉(zhuǎn)基因鼠雜交得到具有口腔食道鱗狀細胞癌的鼠模型。而Caulin等[50]則首次在轉(zhuǎn)基因鼠上建立了具有可誘導(dǎo)性的口腔癌動物模型，他們通過融合人類孕激素受體技術(shù)激活誘導(dǎo)性Cre重組酶的基因改造建立實驗小鼠，然后與ROSA26受體鼠雜交，在小鼠懷孕14.5 d時，向其子宮注射100 μg·kg-1的RU486激活，之后不再暴露于RU486，其子代在5個月出現(xiàn)口腔癌。Huang等[51]則通過新興的規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly inter spaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9技術(shù)建立p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）敲除的人舌鱗狀細胞癌SCC-9細胞株來探究p75NTR的生物學(xué)作用，CRISPR/Cas9技術(shù)的DNA切割僅僅依靠一小段RNA而不是整個基因工程蛋白，更加便捷高效[52]，同時可有效應(yīng)用于多種生物的基因編輯中[53-54]。這提示可將該技術(shù)與移植動物模型相結(jié)合，有效建立多種口腔癌動物模型，但其“脫靶”現(xiàn)象仍需進一步深入研究來解決[55]。

轉(zhuǎn)基因法相比于其他構(gòu)建口腔癌動物模型的方法來說，其優(yōu)勢在于它使對腫瘤的研究深入至細胞和分子水平，精準(zhǔn)到基因表達的失活或增強；對于研究口腔正常組織發(fā)展到口腔黏膜癌前病變，進而惡化形成口腔癌的分子機制，具有重要意義。但它也存在著一些局限性：難以控制產(chǎn)生單一部位的腫瘤，常有多部位出現(xiàn)瘤灶，不符合人體口腔癌癌變部位較為局限的性質(zhì)；轉(zhuǎn)基因常導(dǎo)致的基因增添或缺失，無法模擬腫瘤發(fā)生中的基因局部突變；同時其動物模型成活率較低等。

3 展望

用于口腔黏膜癌前病變及口腔癌研究的動物模型，已經(jīng)從腫瘤上皮細胞培養(yǎng)物，發(fā)展到體內(nèi)模擬口腔癌遺傳學(xué)、病理特征和腫瘤-基質(zhì)相互作用的系統(tǒng)性口腔癌患者的發(fā)展情況。在癌癥免疫治療和精準(zhǔn)治療時代，使用疾病模型進行系統(tǒng)地測試，是口腔癌預(yù)防和治療干預(yù)的必要手段，也是研究口腔癌發(fā)生機制的重要方法。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。