余麗 劉旭倩 陳雨荷 陳瀟 聶敏海

1.西南醫(yī)科大學口頜面修復(fù)重建與再生實驗室，瀘州 646000；

2.西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，瀘州 646000；

3.北海道大學齒學院口腔病態(tài)學分野口腔診斷內(nèi)科學教室，日本北海道 060-0808；

4.綿陽市口腔醫(yī)院正畸科，綿陽 621000

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部常見的高侵襲性腫瘤[1]，也是人類的第6大惡性腫瘤，嚴重威脅著患者的生命健康和生存質(zhì)量。OSCC約占頭頸部腫瘤的95%[2]，占全身腫瘤的2%～4%以上[3]；OSCC患者的5年生存率僅為50%[4-5]。小分子鋅指蛋白（LIM domain only proteins，LMO）[6]是核轉(zhuǎn)錄家族的共同調(diào)節(jié)子，在胚胎發(fā)育過程中調(diào)控細胞的增殖分化、組織形成和器官發(fā)育，LMO通過介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間及蛋白質(zhì)與各種轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用，促進或抑制基因轉(zhuǎn)錄；LMO可通過調(diào)控細胞周期促進腫瘤形成。LMO家族有4個成員[7]，LMO1、LMO2、LMO3、LMO4。LMO1主要由2個呈直線排列富含半胱氨酸的LIM結(jié)構(gòu)域組成，可作為蛋白質(zhì)相互作用的適配器，結(jié)合其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，破壞其原有結(jié)構(gòu)，通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性、細胞增殖分化促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[8-9]。李曉燕[10]在LMO1上調(diào)食管鱗癌的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）的研究中發(fā)現(xiàn)，138例食管鱗狀細胞癌組織和癌旁組織中LMO1的陽性表達率分別為86.9%和50.7%，LMO1在食管鱗狀細胞癌中的表達明顯高于癌旁組織（P＜ 0.001）。OSCC與食管鱗狀細胞癌同屬于上皮源性腫瘤，LMO1是否會促進口腔黏膜癌變，目前尚無相關(guān)研究，蛋白標志物作為腫瘤早期篩查的重要指標，篩選高靈敏度的標志物對腫瘤的研究和治療具有重要意義。因此，本實驗擬對4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline N-oxide，4NQO）飲水法構(gòu)建的SD大鼠口腔頰黏膜組織的mRNA和蛋白進行檢測，以探究LMO1在OSCC發(fā)展進程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

PageRulerPrestained Protein Ladder、Veriti 96- Well聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、高速冷凍離心機、iBright CL1000蛋白印跡智能成像系統(tǒng)（Thermofisher公司，美國），LMO1單克隆抗體（湖北省三鷹生物技術(shù)有限公司），磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（北京Abway抗體技術(shù)有限公司），LMO1引物、GAPDH引物（上海生工生物工程股份有限公司），SYBR?Greenrealtime PCR master mix（TOYOBO公司，日本），DAB試劑盒、PV9000型免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），石蠟包埋機（湖北省亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗樣本

本實驗動物組織均源于本課題組前期4NQO飲水法鱗狀細胞癌動物模型構(gòu)建（已獲得西南醫(yī)科大學倫理委員會的同意和認可），建模方法如下。選取SPF級6周齡雄性SD大鼠84只，按照隨機數(shù)字表法將SD大鼠均分裝到21個飼養(yǎng)籠中，每3籠為一個小組，共7組。采用自動緩控系統(tǒng)控制燈光，設(shè)計晝夜光線明暗度循環(huán)，飼養(yǎng)溫度為20～25 ℃，空氣濕度為40%～60%，保證大鼠有充足的飼料（SPF動物專用飼料由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供）和飲水，少量多次飼養(yǎng)大鼠，保證食物供給充足的同時而不至于喂養(yǎng)過度。7組大鼠中，設(shè)置1組大鼠為對照組，6組為實驗組，實驗組飲用含質(zhì)量分數(shù)為0.004% 4NQO的SPF級純凈無菌水；對照組飲用SPF級純凈無菌水，其余飼養(yǎng)條件相同。

在飼養(yǎng)的12、14、16、18、20、22周，隨機取1組實驗組大鼠乙醚麻醉后，觀察記錄各處病變組織的肉眼觀，頸椎脫臼處死大鼠，立即將組織凍存在-80 ℃冰箱，用于后續(xù)的實時熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative of nucleotide PCR，RT-qPCR）和Western blot實驗，在實驗的第12、14、16、18、20、22周，采用同樣的方法，每次處死對照組大鼠2只，并獲取各病變區(qū)域的頰黏膜組織，-80 ℃冰箱凍存。

本實驗隨機選取上述7組SD大鼠的頰黏膜組織各7例共計49例用于本實驗研究。

1.3 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

隨機選取49例課題組前期建模所得組織切片按說明書進行染色，封片，然后分別由2位高年資病理科醫(yī)師讀片確定病理分級，參考2005年WHO分類標準，分為對照組和實驗組，實驗組包括輕度上皮異常增生組（輕度組）、中度上皮異常增生組（中度組）、重度上皮異常增生組（重度組）和OSCC組。

1.4 免疫組織化學染色實驗

將實驗用一抗兔抗鼠LMO1多克隆抗體稀釋為 1∶100、1∶150、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶700共7個濃度梯度進行試驗性染色，結(jié)果示1∶400稀釋度下染色鑒別力最佳，因此，本實驗采用1∶400的稀釋度按照SP法進行LMO1染色。采用標記指數(shù)半定量分析結(jié)果：標記指數(shù)=陽性染色強度計分+陽性細胞染色率計分。陽性染色強度計分標準：在光學顯微鏡下，排除邊緣效應(yīng)和非特異性染色，其中細胞質(zhì)和細胞核出現(xiàn)棕褐色、棕黃色、黃色記為陽性，無：0分；黃色：1分；棕黃色：2分；棕褐色：3分。陽性細胞率：高倍鏡（× 400）下隨機選取5個視野，利用醫(yī)學圖像分析軟件（Image Pro plus）計算著色細胞所占百分比，0分：陽性細胞率＜10%；1分：11%～25%；2分：26%～49%；3分：≥50%。標記指數(shù)即為兩者相加總分：0～1分為陰性（-），2分為弱陽性（+），3～4分為中陽性（++）；5～6分為強陽性（+++）；其中≥2分均為陽性表達。

1.5 RT-qPCR實驗

依試劑盒說明提取各樣本的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，LMO1引物序列：F：5’-CTTTCGAGATGGTGATGCG-3’；R：5’-ATCTCTGATTGCAGAGTTGG-3’。GAPDH的引物序列：F：5’-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC3’；R：5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’。每組4個復(fù)孔，20 μL體系進行擴增，記錄LMO1和GAPDH的CT值，采用ΔΔCT相對定量法進行計算分析：ΔCT=CT（LMO1基因）-CT（GAPDH基因）；ΔΔCT=ΔCT實驗組-ΔCT對照組；平均相對含量=2-平均ΔΔCT，即實驗組mRNA相比對照組mRNA的變化倍數(shù)。

1.6 Western blot實驗

按蛋白試劑盒說明提取各樣本的蛋白質(zhì)，測蛋白濃度；以每孔50 mg蛋白作為上樣標準，配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，一抗、二抗孵育，顯影，分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果及病理分級的確定

49例SD大鼠口腔頰黏膜組織通過HE染色，依據(jù)組織異常增生的嚴重程度，經(jīng)2位高年資病理科醫(yī)師讀片確定：對照組7例，輕度組6例，中度組11例，重度組9例，OSCC組16例。

對照組上皮細胞結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，層次清晰；輕度組的病變組織主要累及上皮層的l/3，上皮輕度增生，過角化，棘細胞層增厚；中度組的病變組織主要累及上皮層的l/3～2/3，上皮增厚較明顯，基底細胞層數(shù)增加，上皮釘突伸長、變寬，部分釘突呈水滴狀，細胞核濃染；重度組的病變組織超過上皮層的2/3，但尚未突破基底膜，上皮顯著增生變厚，細胞核異型性、濃染，上皮釘突呈水滴狀且相互融合；OSCC組主要表現(xiàn)為上皮層次紊亂，棘細胞層成團角化，上皮釘突增大呈滴狀，基底細胞極性消失，核仁增大，核分裂象，細胞異形性明顯，細胞可以突破基底膜到達固有層，固有層出現(xiàn)癌巢（圖1）。

2.2 免疫組織化學染色實驗定性確定LMO1的表達

免疫組織化學染色將LMO1表達的部位染為黃色或棕褐色，LMO1主要表達于細胞質(zhì)，少量表達于細胞核和細胞膜。LMO1在正?？谇活a黏膜組織中幾乎不表達，因此對照組上皮層無著色。隨著口腔頰黏膜上皮異常增生程度的增加，上皮細胞細胞質(zhì)逐漸被染色，且隨著上皮異常增生程度的增加，上皮細胞的胞質(zhì)染色越來越深，說明LMO1的表達量是逐漸增加的。此外，中度組中個別上皮細胞的細胞核核膜染為淡黃色；重度組中細胞質(zhì)和細胞核核膜被染成棕褐色，細胞核染成淡黃色。而在OSCC組中，上皮細胞的細胞質(zhì)、細胞核和細胞核核膜均出現(xiàn)棕褐色的強陽性染色反應(yīng)，特別在腫瘤細胞浸潤區(qū)染色更深（表1，圖2）。

2.3 大鼠頰黏膜中LMO1 mRNA的表達情況

隨著異常增生程度的加重，LMO1 mRNA的表達逐漸增加，在OSCC組中LMO1 mRNA相對表達量最高，采用One-Way ANOVA的統(tǒng)計方法分析發(fā)現(xiàn)，對照組與輕度組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組組間兩兩比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。與對照組相比，輕度組的mRNA相對表達量上調(diào)1.12倍，中度組上調(diào)1.38倍，重度組上調(diào)1.53倍，OSCC組上調(diào)1.76倍（圖3）。

圖 1 SD大鼠口腔頰黏膜HE染色結(jié)果 HE × 200Fig 1 HE staining of the oral buccal mucosa of SD rats HE × 200

表 1 各組LMO1蛋白的陽性表達率Tab 1 The positive expression of LMO1 in the each group

2.4 大鼠頰黏膜中LMO1蛋白的表達情況

對照組和實驗組中均表達LMO1蛋白，隨著上皮異常增生程度的加重，LMO1蛋白的表達量逐漸增加，對照組LMO1表達量最少，OSCC組LMO1蛋白表達量最高。采用One-Way ANOVA的統(tǒng)計方法分析顯示：與對照組相比，實驗組的LMO1表達量均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與輕度組相比，中度組、重度組和OSCC組表達均高于輕度組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而在中度組、重度組和OSCC組之間LMO1表達無明顯差異（P＞0.05）（圖4）。

3 討論

口腔黏膜癌變過程中常出現(xiàn)組織細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，細胞異形性，上皮細胞可突破基底膜到達固有層并形成癌巢，隨著病程的發(fā)展，癌細胞可能向周圍組織發(fā)生早期轉(zhuǎn)移[11-13]。本實驗研究口腔頰黏膜從正常發(fā)展為OSCC這一過程中LMO1的表達變化，結(jié)果顯示隨著口腔黏膜異常增生程度的增加，LMO1的表達逐漸增加，提示LMO1的表達增加可能促進了腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，使腫瘤的發(fā)展進程加快。同樣，有研究[14]表明，LMO1可能參與了EMT的調(diào)控，LMO1可與堿基序列結(jié)合蛋白GATA3結(jié)合，通過下調(diào)上皮標志物E-鈣黏蛋白、角蛋白等的表達，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，使上皮細胞失去分化特征，細胞極性消失，而波形蛋白等間充質(zhì)標記物的表達增加；同樣在許多原發(fā)腫瘤局部浸潤的早期，可以檢測到EMT相關(guān)基因的表達，LMO1作為蛋白質(zhì)相互作用的適配器，可能與EMT通道中的特定蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，調(diào)控相應(yīng)癌變基因的轉(zhuǎn)錄過程，誘導(dǎo)細胞的異常增生和異常分化，破壞病變部位的組織結(jié)構(gòu)，加快口腔黏膜癌變的進程，從而在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。增殖、分化和凋亡是細胞的基本生命活動，在機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用，細胞周期是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，包括分裂間期與分裂期，所有的生命活動過程都伴隨著細胞的更新與凋亡，而在口腔黏膜癌變過程中，細胞凋亡發(fā)揮著重要的作用，凋亡細胞的增加可以抑制腫瘤細胞的生長，而凋亡細胞的減少則可以促進腫瘤的生長，因此，LMO1可能通過調(diào)控病變部位細胞的細胞周期活動促進口腔黏膜癌變，誘導(dǎo)OSCC的發(fā)生。

圖 2 SD大鼠口腔頰黏膜免疫組織化學染色 SP × 400Fig 2 Immunohistochemical staining of the oral buccal mucosa of SD rats SP × 400

圖 3 SD大鼠頰黏膜LMO1 mRNA的相對表達量Fig 3 LMO1 mRNA expression level of buccal mucosa of SD rats

RT-qPCR結(jié)果表明，與對照組相比，輕度組、中度組、重度組和OSCC組的mRNA相對表達量分別上調(diào)了1.12倍、1.38倍、1.53倍和1.76倍；Western blot實驗中，從對照組到OSCC組，LMO1蛋白的表達量逐漸增加，而在對實驗數(shù)據(jù)進行兩兩分析時發(fā)現(xiàn)輕度組與對照組間mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同樣，Western blot檢測結(jié)果表明，組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，中度組、重度組和OSCC組間LMO1表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其余各組兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。原因可能是組織從正常發(fā)展到OSCC需要先經(jīng)歷異常增生階段，此過程中機體會出現(xiàn)免疫防御反應(yīng)，不同大鼠免疫反應(yīng)強度的不同也有可能導(dǎo)致某些階段LMO1蛋白表達相對減少；同時，4NQO飲水法誘導(dǎo)組織癌變是一連續(xù)的過程，各階段之間過渡的時間較短，病程進展較快，導(dǎo)致在取材時機上把握不夠準確；大鼠之間的個體差異，大鼠間飲水量的差異均有可能對實驗結(jié)果造成一定的影響。各實驗結(jié)果提示，從正常組織誘導(dǎo)為OSCC這一過程中，LMO1在上皮組織中的表達量是有變化的，且變化是有規(guī)律的。

圖 4 Western blot檢測各組LMO1蛋白的表達Fig 4 Western blot analysis of LMO1 protein expression in the each group

蛋白標志物作為腫瘤早期篩查的重要指標，積極尋找合適的蛋白標志物對OSCC的早期診斷和判斷預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。本實驗在保證了病變模型連續(xù)性的同時保證了實驗的樣本量，結(jié)果具有可靠性和指導(dǎo)意義。理論上，為探索口腔黏膜癌變的分子機制提供了新思路，豐富了OSCC蛋白標志物的實驗研究，為阻斷OSCC侵襲轉(zhuǎn)移的途徑提供了新的理論依據(jù)，成果具有應(yīng)用前景。但是LMO1的表達變化在OSCC發(fā)展進程中的具體作用機制，是否調(diào)控EMT進程還尚不明確，這將是后續(xù)進一步研究的方向。

綜上所述，在口腔黏膜癌變模型中，LMO1 mRNA和蛋白異常表達，且mRNA和蛋白表達量與上皮異常增生程度正相關(guān)，均隨著異常增生程度的增加而表達增加。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。