王 希

人乳頭瘤病毒(HPV)是功能基因E1-E7及結(jié)構(gòu)基因L1、L2共同組成的嗜上皮性雙鏈脫氧核糖核酸(dsDNA)，多為一過性感染現(xiàn)象，但仍有10%女性可持續(xù)感染，且HPV持續(xù)感染不僅是宮頸病變的重要危險因素，也是導(dǎo)致宮頸癌的主要病因之一[1-2]。陰道微生態(tài)系統(tǒng)則在生殖道感染、尿道感染的預(yù)防中扮演重要角色，其具有動態(tài)變化特征，并受年齡、經(jīng)期時長、性交頻率等多因素影響。陰道微生物不僅可執(zhí)行生理功能，亦可抵御明顯病原菌或抑制潛在病原菌上，一旦菌群結(jié)構(gòu)失衡，則可增加生物個體感染各種疾病的風(fēng)險[3-4]。同時，有研究[5-6]報道，當(dāng)局部微環(huán)境中炎癥因子發(fā)生異常改變，Th1/Th2平衡被打破，并向Th2漂移，則可引起機體免疫應(yīng)答紊亂，增加患病風(fēng)險。當(dāng)前研究HPV感染、陰道微生態(tài)、炎癥反應(yīng)的臨床報道雖并不少見，但多基于宮頸病變基礎(chǔ)，且診斷方式、所選取指標(biāo)內(nèi)容繁雜不一、研究對象各異，仍有待持續(xù)補充及完善。鑒于此，本研究采集病例，并著重分析HPV感染與陰道微生態(tài)、炎癥反應(yīng)的關(guān)系，旨在進(jìn)一步補充及完善其與陰道微生態(tài)、炎癥反應(yīng)的關(guān)系，為HPV的臨床防治提供參考意見，現(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)性生活規(guī)律；(2)月經(jīng)規(guī)律，經(jīng)期持續(xù)時間為5～7 d；(3)入組前1周內(nèi)無抗生素使用史；(4)樣本采集前3 d內(nèi)無性生活史；(5)無陰道灌洗史；(6)無陰道用藥史；(7)入院后均行HPV、宮頸液基細(xì)胞學(xué)及陰道微生態(tài)檢測；(8)知曉研究內(nèi)容并自愿簽署研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并糖尿病或高血壓疾病；(2)系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人；(3)風(fēng)濕性免疫疾病病人；(4)正在行宮頸病變治療病人；(5)全子宮切除病人；(6)妊娠期、哺乳期女性；(7)合并宮頸癌前病變或?qū)m頸癌病人。

1.2 一般資料 按上述納入與排除標(biāo)準(zhǔn)將2014年1月至2018年2月于我院確診為HPV感染且宮頸液基細(xì)胞學(xué)陰性病人182例設(shè)為HPV感染組，年齡20～48歲，首次性生活年齡18～25歲；另將同期于我院行健康體檢或孕前檢查，HPV及宮頸液基細(xì)胞學(xué)陰性的160名女性設(shè)為對照組，年齡19～49歲，首次性生活年齡18～24歲；2組年齡、首次性生活年齡具有可比性。

1.3 檢測方法 (1)HPV檢驗：應(yīng)用樣本刷在子宮頸、外口順時針旋轉(zhuǎn)5圈收集子宮頸脫落細(xì)胞，并置入保存液，13 000 r/min離心10 min后棄上清液，再加入50 μL裂解液后100 ℃下加熱15 min，13 000 r/min離心10 min后留取上清液；依次PCR擴增、雜交、洗膜、顯色，依據(jù)對照膜條在PC位置上的顯色判定結(jié)果，藍(lán)色提示雜交顯色正常，斑點顯現(xiàn)位置即為HPV亞型。(2)陰道微生態(tài)檢測：應(yīng)用無菌棉拭子留取陰道側(cè)壁上1/3分泌物，第一根棉拭子用pH精密試紙檢測(奧克，pH>4.5即診斷為pH值升高)，0.9%氯化鈉溶液分泌物置于玻片上，400倍鏡下觀察陰道假絲酵母菌病(VVC)、需氧菌性陰道炎(AV；參照Donders診斷表，評分≥3分即診斷為AV陽性)、白細(xì)胞(WBC；>10個/HPF即可診斷為陰道炎癥)及乳桿菌(Ⅱb、Ⅲ即定義為乳桿菌減少)；第二根棉拭子涂片，1 000倍鏡下觀察VVC(結(jié)合10%KOH濕片，發(fā)生芽生孢子或假菌絲即診斷為VVC陽性)、細(xì)菌性陰道病(BV；Nugent≥7分為BV陽性)。(3)炎癥反應(yīng)：暴露宮頸口后應(yīng)用5 mL滅菌0.9%氯化鈉溶液沖洗宮頸口及宮頸表面，后穹隆吸出4 mL灌洗液，混勻后裝入1.5 mL無菌EP管，3 000 r/min 4 ℃條件下離心5 min；取上清液分裝后-80 ℃保存，ELISA雙抗體夾心法檢測上清液中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-4、γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-10水平，并計算IFN-γ/IL-4、IL-2/IL-4比值；其中ELISA試劑盒購自欣博盛(深圳)，酶標(biāo)檢測儀檢測各孔相對應(yīng)OD450值；將每個標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)本的OD值-空白孔OD值，按不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)的OD450為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出相應(yīng)位置樣本中細(xì)胞因子含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t(或t′)檢驗、χ2檢驗和logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 2組陰道微生態(tài)異常情況比較 2組WBC>10個/HPF比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但HPV感染組中BV、VVC及AV陽性、pH>4.5、乳桿菌減少率均高于對照組(P<0.05～P<0.01)(見表1)。

表1 陰道微生態(tài)異常情況在2組中比較(n)

2.2 2組炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較 2組TNF-α、IL-6、IL-10比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但HPV感染組IL-2、IFN-γ、IFN-γ/IL-4、IL-2/IL-4均低于對照組，IL-4高于對照組(P<0.01)(見表2)。

2.3 HPV感染與陰道微生態(tài)、炎癥反應(yīng)的相關(guān)性分析 將HPV感染、陰道微生態(tài)及炎癥反應(yīng)指標(biāo)分別賦值，HPV感染為因變量(陽性=0、陰性=1)，BV(陽性=0、陰性=1)、VVC(陽性=0、陰性=1)、AV(陽性=0、陰性=1)、pH值(>4.5=0、≤4.5=1)、乳桿菌(減少=0、正常=1)、IL-2(與對照組均值95%CI范圍內(nèi)特定值為參考，低于參考值=0，高于參考值=1)、IL-4(低于參考值=0，高于參考值=1)、IFN-γ(低于參考值=0，高于參考值=1)、IFN-γ/IL-4(低于參考值=0，高于參考值=1)、IL-2/IL-4(低于參考值=0，高于參考值=1)，經(jīng)logistic回歸分析，BV、VVC、AV、pH值、乳桿菌、IL-2、IFN-γ、IFN-γ/IL-4、IL-2/IL-4均與HPV感染密切相關(guān)(P<0.05～P<0.01)(見表3)。

表2 2組炎癥反應(yīng)指標(biāo)比較

*p示t′值

表3 HPV感染與陰道微生態(tài)、炎癥反應(yīng)的logistic回歸分析

3 討論

本研究顯示，2組陰道微生態(tài)指標(biāo)中WBC>10個/HPF比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但HPV組中BV、VVC及AV陽性、pH值>4.5、乳桿菌減少比例均顯著低于對照組；且進(jìn)一步logistic回歸分析，BV、VVC、AV、pH值、乳桿菌均是HPV感染的獨立影響因素。其中BV、VVC與HPV感染的臨床報道較多，如孟齡婷等[7-8]報道，BV、VVC與HPV感染密切相關(guān)，本研究結(jié)論均與之一致；分析或與BV、VVC病人乳桿菌下降，普雷沃菌、人形支原體等增加后導(dǎo)致HPV感染風(fēng)險更高有關(guān)。也有部分研究結(jié)論認(rèn)為，VVC系過敏反應(yīng)的一種，其雖可引起局部血管擴張，增加血管通透性并引發(fā)炎癥反應(yīng)，但對陰道菌群無明顯破壞作用，因此，VVC與HPV感染的關(guān)系仍有待持續(xù)補充及完善[9-10]。

同時，夏玉潔等[11]報道HPV組中AV陽性比例高達(dá)75.0%，提示AV亦是HPV感染的重要影響因素，本研究結(jié)論與之相一致，分析或因AV感染引起中重度炎癥反應(yīng)后，受慢性炎癥刺激影響，機體自然免疫反應(yīng)機制被抑制，故具更高的感染風(fēng)險；潘穎等[12]則報道，HPV病人陰道菌群中乳桿菌明顯減少，亦與本研究結(jié)論相一致；究其原因，正常情況下，陰道微生物中，乳桿菌占優(yōu)勢地位，其系維持陰道生態(tài)平衡、抑制病原微生物生長、增強陰道局部抗感染能力及抗腫瘤能力的重要菌落，一旦乳桿菌減少，其便難以發(fā)揮對應(yīng)生理功能。而pH作為評價陰道微生態(tài)的綜合評價指標(biāo)，一般正常女性陰道pH值維持在3.8～4.5之間，一旦宿主機體狀態(tài)發(fā)生變化，陰道內(nèi)乳桿菌減少便可直接影響乳酸分泌，導(dǎo)致pH值異常上升，而pH值上升又進(jìn)一步加重陰道微生態(tài)紊亂，并增加HPV感染風(fēng)險，這與韓一栩等[13]的報道結(jié)論相一致，均提示陰道pH值與HPV感染密切相關(guān)；溫先勇等[14]采集617例HPV感染者進(jìn)行研究后亦指出，陰道酸堿度是影響HPV感染率的重要因素。

本研究還顯示，2組TNF-α、IL-6、IL-10比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但HPV感染組IL-2、IFN-γ、IFN-γ/IL-4、IL-2/IL-4顯著低于對照組，IL-4高于對照組，進(jìn)一步logistic回歸分析顯示，HPV感染與IL-2、IFN-γ、IL-4、IFN-γ/IL-4、IL-2/IL-4密切相關(guān)。其中IL-2作為免疫應(yīng)答及免疫調(diào)節(jié)的核心因子，直接影響免疫細(xì)胞功能及宮頸局部免疫狀態(tài)，并可增強巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤的活性；IFN-γ則由活化的TH、NK細(xì)胞產(chǎn)生，主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，是促進(jìn)Th1細(xì)胞發(fā)育、抑制Th2細(xì)胞活性及增殖的重要細(xì)胞因子；IL-4則主要由激活的Th2細(xì)胞分泌，可促進(jìn)Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，并抑制其向Th1細(xì)胞分化；正常情況下，Th1、Th2細(xì)胞相互拮抗維持平衡，一旦其向Th2偏移，即可引起機體免疫應(yīng)答紊亂，增加HPV感染風(fēng)險[15-16]。

綜上所述，HPV感染與陰道微環(huán)境、炎癥反應(yīng)具一定關(guān)聯(lián)性，積極糾正陰道微環(huán)境紊亂，改善局部炎癥反應(yīng)，或可降低HPV感染風(fēng)險。