余定玥，郭加友，馮 琛，馬志宇，郭嘉漪，馬建新

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤。全球每年新增食管癌40余萬，包括2種主要組織學(xué)亞型：食管鱗癌和食管腺癌。我國為食管鱗癌的高發(fā)地區(qū)。早期食管鱗癌病人優(yōu)先選擇外科手術(shù)治療，然而，食管癌的早期往往是非特異性的，大多數(shù)病人不重視本病，延誤病情，喪失了手術(shù)切除的機(jī)會(huì)。因此放射治療被廣泛應(yīng)用于中晚期食管癌病人中，尤其是食管鱗癌[1]。然而食管癌細(xì)胞對放射治療為中度敏感，除食管癌的分期分型外，放射抗性也是局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因之一[2]。因此尋找高效安全、優(yōu)質(zhì)價(jià)廉的藥物，用來增加腫瘤組織細(xì)胞的放射敏感性有著十分重要的臨床意義。丹皮酚是徐長卿粉末和牡丹皮，在中藥提取為一種小分子酚類化合物，白色針狀樣晶體，化學(xué)名稱為2-羥基-4-甲氧基苯乙酮，相對分子質(zhì)量為166，分子式為C9H10O3。丹皮酚味苦、辛，熔點(diǎn)較低(51～52 ℃)，微溶于水，溶于乙醇、三氯甲烷、乙醚、丙酮、苯和二硫化碳等有機(jī)溶劑[3]。近些年大量研究[4-6]均表明，在肝癌、食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌等體內(nèi)外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，丹皮酚可通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，既有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期，又有影響腫瘤血管生成、促進(jìn)機(jī)體白細(xì)胞介素(IL)-2及腫瘤壞死因子α(TNF-α)生成的作用，以此發(fā)揮明顯抗癌效應(yīng)的作用。因此本研究以食管鱗癌細(xì)胞株KYSE450和TE10為研究對象，探討丹皮酚對食管癌放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 丹皮酚(Sigma公司)以二甲基亞砜(DMSO)為原料，4 ℃儲(chǔ)存在冰箱中。用RPMI 1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)稀釋成工作液。工作液中DMSO(美國Sigma公司)的最終濃度≤0.1%。胎牛血清、胰蛋白酶購自GIBCO公司，細(xì)胞增殖毒性試驗(yàn)(CCK8)試劑盒、蛋白提取試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、GAPDH抗體購自CST公司。流式細(xì)胞術(shù)(FCM)是美國BD公司的產(chǎn)品，化學(xué)發(fā)光儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人類食管癌細(xì)胞株KYSE450、TE10購于上海細(xì)胞所。在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中每隔2～3 d傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞照射(IR) 采用瑞典Elekta醫(yī)用直線加速器6 MV-X，將細(xì)胞培養(yǎng)皿放在1 cm厚有機(jī)玻璃板上，源皮距為100 cm，框架角度為180°照射，每分鐘劑量率為450 cGy。

1.4 CCK8實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化并按4×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后將丹皮酚按濃度梯度20、40、80、160、320 mg/L加入96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對照組(不含丹皮酚，含等量培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。避光加入CCK8檢測液(由CCK8原液與空白培養(yǎng)基1∶10配置)，每組設(shè)置一個(gè)空白組(不含細(xì)胞，只含CCK8檢測液)，繼續(xù)在5% CO2孵箱中37 ℃培養(yǎng)2 h，然后用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞的450 nm吸光度(A)。采用細(xì)胞存活率=(加藥組值-空白組)/(對照組值-空白組)×100%方式計(jì)算細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，繪制藥物濃度-效應(yīng)曲線，以平均值、藥物濃度為橫坐標(biāo)、存活分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，并計(jì)算半數(shù)最大抑制濃度(IC50)。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)。依照每塊6孔板接受的不同劑量(0、2、4、6、8 Gy)分別接種相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)(300、600、1 200、3 000、6 000個(gè)/孔)，置入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞孵箱中過夜培養(yǎng)，然后加入40 mg/L、100 mg/L的丹皮酚工作液，將細(xì)胞分組為：對照組、40 mg/L丹皮酚組和100 mg/L丹皮酚組，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行照射。X射線照射后4 h更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d肉眼可見克隆后收獲細(xì)胞。棄去培養(yǎng)基，加入1 mL PBS清洗2次后，加入1 mL多聚甲醛固定15 min，再加入雙蒸水清洗干凈后加入1%結(jié)晶紫染色30 min。再次雙蒸水清洗干凈。在處理過程中動(dòng)作輕柔，切勿損傷細(xì)胞克隆。6孔板室溫下風(fēng)干后在顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆(≥50細(xì)胞)個(gè)數(shù)。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞術(shù) 取對數(shù)生長期的食管癌細(xì)胞株KYSE450和TE10細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，按1×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中。將種植好的6孔板按照以下分組：對照組、40 mg/L丹皮酚組和100 mg/L丹皮酚組。同時(shí)設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。過夜培養(yǎng)后，吸凈6孔板內(nèi)原有的培養(yǎng)基，按照分組分別加入含有濃度為40 mg/L、100 mg/L的丹皮酚工作液。處理后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)。24 h后，予以8 Gy的X射線照射。照射后，將細(xì)胞放入細(xì)胞孵箱中，繼續(xù)穩(wěn)定培養(yǎng)。48 h后收集細(xì)胞上清及胰酶消化所有細(xì)胞放入編號相應(yīng)的離心管內(nèi)。離心，用PBS輕柔吹洗2～3次。將收集到的細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞流式管，離心棄上清后每管加入300 μL的結(jié)合緩沖液，再加入FITC標(biāo)記的Annexin-V(20 μg/mL)10 μL，而后加入PI(50 μg/mL)5 μL，輕柔混勻后避光反應(yīng)15 min后上機(jī)檢測。1 h內(nèi)結(jié)束所有的細(xì)胞標(biāo)本檢測。

1.7 Western blotting實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)按要求分組，每次處理后根據(jù)蛋白提取試劑盒的指示提取總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度并配平，加入5×上樣緩沖液混勻，煮沸約5 min。每泳道加入20 μL樣品，SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用10%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗滌3次，每次10～15 min，一抗(Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3、PARP、GAPDH抗體均按1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜)，然后TBST洗滌3次，每次10～15 min。用1∶2 000稀釋的抗兔抗體和抗鼠抗體在搖瓶中孵育1 h后，用TBST洗滌3次，每次洗滌10～15 min，而后利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 丹皮酚抑制食管癌細(xì)胞的增殖活性 CCK8實(shí)驗(yàn)表明丹皮酚對于食管鱗癌細(xì)胞具有顯著的藥物毒性，它能夠抑制食管鱗癌的增殖活性，其作用是劑量依賴性的(P<0.05～P<0.01)(見表1)。丹皮酚作用細(xì)胞24 h后，其在KYSE450和TE10細(xì)胞中的IC50分別為104.48 mg/L和207.87 mg/L。因此，選擇40 mg/L和100 mg/L濃度的丹皮酚應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測食管癌細(xì)胞增殖活力(%；ni=12)

q檢驗(yàn)：與空白組比較*P<0.05；與丹皮酚20 mg/L組比較#P<0.05；與丹皮酚40 mg/L組比較△P<0.05；與丹皮酚80 mg/L組比較◇P<0.05；與丹皮酚160 mg/L組比較□P<0.05

2.2 丹皮酚對人食管鱗癌細(xì)胞KYSE450和TE10克隆形成能力的影響 為了驗(yàn)證丹皮酚關(guān)于食管鱗癌細(xì)胞的放射治療增敏作用，我們用不同濃度的丹皮酚處理食管鱗癌細(xì)胞。經(jīng)過單擊多靶模型處理后，丹皮酚抑制KYSE450細(xì)胞的克隆形成，并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系(見圖1A)。應(yīng)用單擊多靶模型公式[SF=1-(1-e-D/D0)n]計(jì)算SF值。丹皮酚在TE10細(xì)胞的克隆形成實(shí)驗(yàn)中同樣表現(xiàn)出顯著差異(見圖2B),放射治療劑量在2 Gy時(shí)，40 mg/L或100 mg/L濃度的丹皮酚處理后的KYSE450細(xì)胞的存活率(SF2)分別為0.48和0.37(見表2)；同樣處理后的TE10細(xì)胞的存活率(SF2)分別為0.48和0.35(32)。

表2 丹皮酚對于KYSE450細(xì)胞的放射治療增敏作用

表3 丹皮酚對于TE10細(xì)胞的放射治療增敏作用

2.3 丹皮酚聯(lián)合X射線照射對于人食管癌細(xì)胞KYSE450和TE10細(xì)胞凋亡率影響 流式細(xì)胞儀檢測丹皮酚或/和放射治療(8 Gy)處理后的細(xì)胞凋亡率(見表4)。與丹皮酚、放射治療單獨(dú)處理組相比，KYSE450和TE10細(xì)胞的聯(lián)合處理組凋亡率顯著增加(見圖2)。隨著丹皮酚的給藥劑量增加，兩者聯(lián)合作用的促凋亡作用更加明顯(P<0.01)。結(jié)果表明，丹皮酚能提高食管鱗癌細(xì)胞的凋亡率，提高其放射治療敏感性。

表4 流式細(xì)胞儀檢測食管癌細(xì)胞凋亡率(%)

2.4 丹皮酚對于食管鱗癌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為了探究丹皮酚的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。比較不同處理措施后KYSE450和TE10兩株細(xì)胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、PARP蛋白的表達(dá)情況。蛋白電泳實(shí)驗(yàn)表明在丹皮酚作用影響下，KYSE450和TE10細(xì)胞中促凋亡蛋白PARP、caspase-3、cleaved caspase-3和Bax的表達(dá)上調(diào)。相反，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)受到了抑制(見圖3)。

3 討論

食管癌是人類健康的一個(gè)重要威脅，尤其在我國食管癌的診治主要受到病人無早期特異性癥狀的影響，導(dǎo)致延誤病情，癌癥發(fā)展，喪失手術(shù)醫(yī)治時(shí)機(jī)。因此對于局部晚期的食管癌而言，放射治療是無法手術(shù)的食管鱗癌病人的最佳選擇。近年來發(fā)現(xiàn)，放射耐受是癌癥病人預(yù)后不良的重要原因之一，因而尋找高效低毒的藥物以提高腫瘤組織放射敏感性是目前各項(xiàng)研究工作的重點(diǎn)。

近年來各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚在肺癌、肝癌、食管癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。丁文秋等[7]發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能夠通過影響凋亡相關(guān)蛋白，促進(jìn)肺癌小凋亡，抑制肺癌細(xì)胞增殖，而發(fā)揮抗腫瘤的作用。劉思涵[8]研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚，能夠抑制cox-2、Bcl-2和survivin的表達(dá)，從而起到抑制裸鼠體內(nèi)食管癌細(xì)胞移植瘤的生長，并誘導(dǎo)凋亡作用的發(fā)生，最終發(fā)揮抗腫瘤作用。楊震等[9]實(shí)驗(yàn)表明，丹皮酚能夠抑制體內(nèi)外食管鱗癌細(xì)胞株ECA-109的增長，誘導(dǎo)其凋亡。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹皮酚對食管癌細(xì)胞株KYSE450和TE10具有抑制其增殖的作用。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹皮酚提高放療后細(xì)胞的凋亡率，從而起到放療增敏的作用。

我們對凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行了檢測，證明了丹皮酚能夠通過調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而對食管癌細(xì)胞起到抗腫瘤及放療增敏的作用。細(xì)胞凋亡是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、調(diào)控機(jī)體發(fā)育及衰老的重要機(jī)制[10]。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖通常是動(dòng)態(tài)平衡的，一旦各項(xiàng)機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡失衡，就會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，這也是各種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[11]。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的相互作用，影響著內(nèi)源性線粒體途徑相關(guān)的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的調(diào)控[12],從而影響下游分子PARP導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[13]。在Western blotting實(shí)驗(yàn)中，我們檢測到，與兩種不同濃度的丹皮酚單純加藥組和單純放療組相比，Bcl-2在兩種濃度的丹皮酚聯(lián)合放療組中均有不同程度的下調(diào)，同時(shí)促凋亡蛋白Bax、caspase-3、cleave caspase-3、PARP均表現(xiàn)為上調(diào)。因此我們可以認(rèn)為，在丹皮酚的作用下，Bax/Bcl-2比率增加，激活caspase蛋白的裂解，從而直接上調(diào)PARP蛋白的表達(dá)，啟動(dòng)凋亡程序的發(fā)生，導(dǎo)致食管癌細(xì)胞的凋亡，起到放療增敏，發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究表明，丹皮酚體外食管癌細(xì)胞放療增敏的機(jī)制可能與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3、cleave caspase-3和PARP有關(guān)。然而放療增敏機(jī)制更為復(fù)雜，可能涉及到多個(gè)信號通路。尤其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，丹皮酚的放療增敏機(jī)制值得進(jìn)一步的研究探討。同時(shí)丹皮酚對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控是否具有特異性，也值得深入的研究。