付可飛,連惠婷,魏曉峰,孫向英,劉 斌

(華僑大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,分子設(shè)計(jì)與綠色轉(zhuǎn)化福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廈門(mén) 361021)

L-半胱氨酸(L-Cys)是含有還原性巰基的α-氨基酸,是組成生物體蛋白質(zhì)的重要氨基酸,屬于非必需氨基酸[1].L-Cys在機(jī)體蛋白質(zhì)的生物活性調(diào)節(jié)及細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著不可或缺的作用,生命體內(nèi)L-Cys的水平異常與肝臟損傷、皮膚病變及神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病相關(guān)[2].L-Cys的定量識(shí)別方法有高效液相色譜法[3]、光譜法[4,5]和電化學(xué)傳感器法[6]等.電化學(xué)傳感器法因其快速、靈敏、成本低、可原位及在線監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而日益受到關(guān)注.L-Cys的電化學(xué)活性較弱,在其電化學(xué)定量識(shí)別過(guò)程中通常會(huì)產(chǎn)生較高的過(guò)電位,從而影響手性識(shí)別效果.因此,在電化學(xué)分析過(guò)程中,常采用納米材料修飾電極以解決其過(guò)電位問(wèn)題[7].電化學(xué)阻抗型傳感器是借助小幅度擾動(dòng)的非破壞性檢測(cè)技術(shù)[8],具有優(yōu)異的選擇性與靈敏度,簡(jiǎn)便、快捷,可實(shí)現(xiàn)原位、無(wú)損及在線監(jiān)測(cè),可以拓展到L/D-賴氨酸、D-葡萄糖等弱電活性或者非電活性手性物質(zhì)的電化學(xué)識(shí)別研究中[9,10].

環(huán)糊精(CD)是經(jīng)典的手性傳感膜制備材料,是由n個(gè)α-1,4-D-吡喃葡萄糖苷組成的手性低聚糖分子,按照n的大小(n=6～8)分為α-CD,β-CD和γ-CD.CD的內(nèi)腔呈疏水特性,外腔呈親水性,具有合適尺寸和疏水性質(zhì)的客體分子能夠進(jìn)入其空腔中,形成主客體超分子體系[11,12].層層自組裝技術(shù)能夠得到高度有序的納米級(jí)傳感膜結(jié)構(gòu),膜的厚度、成分、結(jié)構(gòu)和性能可調(diào)控,適于在多種基底上修飾[13],該技術(shù)因具有簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定及靈活的優(yōu)勢(shì)而在手性電化學(xué)傳感器中應(yīng)用較多[14,15].

本文利用電化學(xué)阻抗譜技術(shù),結(jié)合具有豐富手性識(shí)別位點(diǎn)的γ-CD膜,構(gòu)建了高靈敏的γ-CD基選擇性阻抗型傳感器,以實(shí)現(xiàn)對(duì)L-Cys的阻抗定量識(shí)別.根據(jù)量子化學(xué)預(yù)分析結(jié)果推算出能與γ-CD特異結(jié)合的潛在弱電活性手性氨基酸,準(zhǔn)確提高了該靶標(biāo)阻抗識(shí)別的靈敏度和選擇性,并有效應(yīng)用于實(shí)際樣品的分析中,為測(cè)定弱電化學(xué)活性物質(zhì)的電分析傳感器的開(kāi)發(fā)提供了新思路.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

L/D-半胱氨酸鹽酸鹽購(gòu)于J&K百靈威科技有限公司;L/D-青霉胺(L/D-Pen)、高型半胱氨酸(Hcy)和α/β/γ-環(huán)糊精(α/β/γ-CD)購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司; 其它試劑均為分析純; 實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q 超純水儀制備; 血清樣品由華僑大學(xué)校醫(yī)院提供; 舒邦膠囊由遠(yuǎn)大醫(yī)藥(中國(guó))有限公司提供.

CHI660E型電化學(xué)工作站和CHI920D型掃描電子顯微鏡(SEM)購(gòu)于上海辰華儀器公司; S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡購(gòu)于日本Hitachi公司; Nicolet iS 50型傅里葉變換紅外光譜儀購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司; Milli-Q型超純水儀購(gòu)于美國(guó)Millipore公司.實(shí)驗(yàn)采用三電極體系: 工作電極為直徑2 mm的圓盤(pán)玻碳電極(GCE),對(duì)電極為鉑絲電極(Pt),參比電極為銀/氯化銀電極(Ag/AgCl).

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 電化學(xué)阻抗譜(EIS)實(shí)驗(yàn)在含有0.1 mol/L KCl的PBS緩沖溶液(pH=7.00)中進(jìn)行,開(kāi)路電位下設(shè)置頻率范圍為100 mHz～100 kHz,交流電壓振幅為5 mV,所有阻抗數(shù)據(jù)均用ZSimpWin軟件擬合等效電路圖并得出電化學(xué)阻抗值,等效模擬電路為R(Q(R(QR))).微分脈沖伏安(DVP)實(shí)驗(yàn)在pH=7.00的PBS緩沖溶液中進(jìn)行,電位設(shè)置為0～1.0 V(vs.Ag/AgCl,下同),電位增量0.008 V,脈沖寬度0.05 s,脈沖周期0.5 s.循環(huán)伏安(CV)實(shí)驗(yàn)在含有0.1 mol/L KCl 的pH=7.00的PBS緩沖溶液中進(jìn)行,電位設(shè)置為-0.2～+0.6 V,掃描速率為0.1 V/s.

場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)表征設(shè)置加速電壓為3.0 kV,樣品經(jīng)過(guò)高溫真空干燥.傅里葉變換紅外光譜(FTIR)實(shí)驗(yàn)是將組裝至玻碳片上的γ-CD與少量干燥的KBr混合研磨壓片,采集4000～ 400 cm-1范圍內(nèi)的數(shù)據(jù).掃描電化學(xué)顯微鏡(SECM)表征包含氧化吸附與解吸附實(shí)驗(yàn): 氧化吸附實(shí)驗(yàn)在pH=7.00的PBS緩沖溶液中進(jìn)行,電位設(shè)置為0～0.8 V,CV曲線掃描圈數(shù)為15圈,掃描速率為0.1 V/s; 解吸附實(shí)驗(yàn)在pH=7.50的PBS緩沖溶液中進(jìn)行,基底電極設(shè)置恒電位為-0.8 V,鉑探針CV過(guò)程的電位設(shè)置為-0.8～0 V,掃描速率為0.05 V/s.

Scheme 1 Schematic description of the preparation and sensing of γ-CD-based electrochemical sensor

1.2.2 環(huán)糊精基傳感器的構(gòu)建與傳感檢測(cè) 將玻碳電極分別用粒徑為1.0,0.3和0.05 μm的Al2O3拋光粉打磨拋光后,用體積分?jǐn)?shù)50%的HNO3、無(wú)水乙醇及水分別超聲清洗3 min,至電極表面呈疏水鏡面,自然晾干.取150 mgγ-CD溶解于pH=5.00的醋酸緩沖溶液中,定容至10 mL,配制成15.0 g/L的γ-CD儲(chǔ)備溶液(pH=5.00),備用.將玻碳電極浸入15.0 g/L的γ-CD溶液(pH=5.00)中,以冰水浴控制溫度為12 ℃,放置3 h后取出[15],自然晾干,即得環(huán)糊精基傳感器.測(cè)試前,將該傳感器先在PBS緩沖液中通過(guò)DVP法使L-Cys電氧化吸附至手性傳感膜表面,再置于0.2 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中測(cè)定其電化學(xué)阻抗譜.傳感器的構(gòu)建與傳感過(guò)程如Scheme 1所示.

1.2.3 實(shí)際樣品的測(cè)試 血清樣品由華僑大學(xué)校醫(yī)院提供.取20 μL血清溶解于10 mL pH=7.00的PBS緩沖液中,加入不同濃度的L-Cys標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn).將舒邦膠囊用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解后,離心、洗滌,上層清液用pH=7.00的PBS緩沖液稀釋100倍,加入不同濃度的L-Cys標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn).

2 結(jié)果與討論

2.1 L-Cys的伏安行為

采用循環(huán)伏安法探究了L-Cys的氧化還原性質(zhì),結(jié)果見(jiàn)圖1.圖1(A)為不同濃度L-Cys的CV響應(yīng)曲線[16],不同濃度L-Cys位于0.6 V處的氧化峰電流(Ip)與濃度(c)的線性擬合方程為Ip=9.215+352.7c,R2=0.9617; 圖1(B)為L(zhǎng)-Cys連續(xù)施加20次DPV信號(hào)所得曲線圖.由CV曲線可見(jiàn),L-Cys僅在0.6 V處出現(xiàn)氧化信號(hào)峰,且氧化峰電位隨其濃度的增大而逐漸正移,氧化峰電流隨著L-Cys濃度的增大而逐漸增大,具有一定的線性關(guān)系,這表明L-Cys在未修飾電極上的電化學(xué)過(guò)程為不可逆過(guò)程.由DPV曲線可見(jiàn),L-Cys在0.6 V處的氧化峰電流(Ip)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為41.96%(n=20),氧化峰電位的RSD為2.65%(n=20),這進(jìn)一步表明L-Cys在氧化過(guò)程中具有較高的過(guò)電位,從而不利于電流型傳感器對(duì)其進(jìn)行定量識(shí)別分析[7].L-Cys在電極表面的氧化機(jī)理如Scheme 2所示[17].

Fig.1 CV(A) and DPV(B) responses of L-Cys on GCE

Scheme 2 Oxidation mechanism of L-Cys

2.2 L-Cys在未修飾電極上的阻抗響應(yīng)

[Fe(CN)6]3-/4-在未修飾電極上的阻抗信號(hào)能夠隨著L-Cys濃度的改變而發(fā)生變化,實(shí)驗(yàn)考察了阻抗信號(hào)與L-Cys濃度的關(guān)系,向[Fe(CN)6]3-/4-溶液中加入不同濃度的L-Cys,測(cè)定其電化學(xué)阻抗信號(hào).結(jié)果表明,L-Cys濃度[c(μmol/L)]在0.01～0.1 μmol/L及0.1～1.0 μmol/L范圍內(nèi),ΔR與L-Cys濃度呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性,檢出限LOD為8.26 nmol/L(S/N=3).其中,L-Cys濃度在0.01～0.1 μmol/L范圍內(nèi),ΔRet1與c的線性回歸方程為ΔRet1=1370c+8.574(R2=0.9926);L-Cys濃度在0.1～1.0 μmol/L范圍內(nèi),ΔRet2與c的線性回歸方程為ΔRet2=198.0c+135.6(R2=0.9928).

實(shí)驗(yàn)比較了不同含巰基物質(zhì)(D-Cys,Hcy和L/D-Pen)在未修飾電極上的阻抗響應(yīng)情況,以分析對(duì)象L-Cys為基準(zhǔn),用L-Cys的阻抗改變量與其它物質(zhì)的阻抗改變量的比值(即選擇性系數(shù)ΔRL-Cys/ΔRother)表示該方法對(duì)L-Cys識(shí)別的選擇性,由此關(guān)系可知,選擇性系數(shù)越高,說(shuō)明該方法的選擇性越好.由表1結(jié)果可見(jiàn),選擇性系數(shù)均大于1,說(shuō)明未修飾電極對(duì)不同含巰基物質(zhì)均具有一定的阻抗識(shí)別效果,但對(duì)L-Cys呈現(xiàn)出最佳的識(shí)別效果.這可能是由于該類有機(jī)物分子均能夠吸附在玻碳表面形成一層弱導(dǎo)電性膜,使[Fe(CN)6]3-/4-在未修飾電極表面的電子傳遞受阻,其中L-Cys與未修飾電極的弱相互作用最強(qiáng),使未修飾電極表面的導(dǎo)電性改變最大,阻抗識(shí)別效果最好.

Table 1 Selectivity coefficients of various structural analogues on bare GCE

綜上所述,L-Cys在未修飾電極上表現(xiàn)出較好的阻抗識(shí)別效果,但其特異識(shí)別性有待進(jìn)一步提高.

2.3 SEM與量化模擬分析

2.3.1 SEM分析 SECM利用掃描探針的電化學(xué)傳感功能,能夠以高的空間分辨率進(jìn)行表面電化學(xué)研究[17],在電化學(xué)分析中的應(yīng)用較廣.為了考察L-Cys的電氧化產(chǎn)物對(duì)傳感膜的影響,采用SECM方法對(duì)比探究了L-Cys在GCE及環(huán)糊精基傳感器中的電氧化與解吸附過(guò)程[18].

利用CV法分別將L-Cys電氧化吸附至GCE及環(huán)糊精基傳感膜表面,再于pH=7.50的PBS緩沖溶液中,分別對(duì)基底電極(GCE或環(huán)糊精基傳感器)施加-0.8 V的恒電位,對(duì)鉑探針施加CV信號(hào),結(jié)果如圖3所示.由圖3(A)和(C)可知,L-Cys在GCE和環(huán)糊精基傳感器上均于0.6 V處出現(xiàn)氧化信號(hào)峰; 由圖3(B)和(D)可知,L-Cys在GCE表面解吸附,又在鉑探針表面于-0.54 V處生成微弱的新氧化峰信號(hào)[19]; 然而,L-Cys在環(huán)糊精基傳感器表面無(wú)對(duì)應(yīng)的解吸附峰產(chǎn)生,可能未發(fā)生解吸附過(guò)程.這可能是由于環(huán)糊精基手性傳感膜含有大量羥基,這些羥基與胱氨酸的氨基、羧基之間能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的氫鍵作用,使L-Cys氧化產(chǎn)物不易從手性傳感膜表面解吸附,導(dǎo)致環(huán)糊精基傳感器的阻抗信號(hào)發(fā)生明顯改變.

Fig.3 Electro-oxidation(A,C) and desorption(B,D) on bare GCE(A,B) and γ-CD-based sensor(C,D)

2.3.2 量子化學(xué)模擬計(jì)算 通過(guò)量子化學(xué)模擬計(jì)算能夠研究主-客體分子之間的相互作用關(guān)系[20],Cys氧化產(chǎn)物胱氨酸的不同構(gòu)型與環(huán)糊精具有不同的作用關(guān)系,通過(guò)量子化學(xué)計(jì)算能夠說(shuō)明環(huán)糊精基傳感器的選擇性特征[21,22].因此,可通過(guò)計(jì)算比較γ-CD與不同構(gòu)型Cys氧化產(chǎn)物之間的結(jié)合能、氫鍵差異,揭示環(huán)糊精基傳感器對(duì)于Cys不同構(gòu)型阻抗識(shí)別的內(nèi)在機(jī)制.

圖4示出了γ-CD-L/D-Cys的分子軌道圖.圖4(A)～(F)為γ-CD-L-Cys超分子體系(L體系)中152,369,387,388,389和391這6個(gè)分子軌道內(nèi)的原子發(fā)生主-客體相互作用的示意圖,經(jīng)基組重疊誤差(BSSE)校正[23,24]后的弱相互作用能EL=-12.6 eV,L體系中L-胱氨酸的O192與γ-CD的O91形成的氫鍵作用最強(qiáng),鍵長(zhǎng)為103 pm,鍵價(jià)SL= 0.69.圖4中(G)～(L)為γ-CD-D-Cys超分子體系(D體系)中360,367,390,394,396和397這6個(gè)分子軌道內(nèi)的原子發(fā)生主-客體相互作用的示意圖,經(jīng)BSSE校正后的弱相互作用能ED=-2.7 eV(約為EL的1/4),D體系中D-Cys的O186與γ-CD的O91形成的氫鍵作用最強(qiáng),鍵長(zhǎng)為143 pm,鍵價(jià)SD=0.34.

Fig.4 Molecular occupied orbitals 152(A),369(B),387(C),388(D),389(E),391(F) for γ-CD-L-Cys and 360(G),367(H),390(I),394(J),396(K),397(L) for γ-CD-D-Cys

計(jì)算結(jié)果表明,L-Cys與γ-CD的手性空間位點(diǎn)更加匹配,L-Cys氧化產(chǎn)物與γ-CD之間的結(jié)合力比D-Cys氧化產(chǎn)物與γ-CD之間的結(jié)合力強(qiáng)[25].據(jù)此推測(cè),與D-Cys相比,由于L-Cys的氧化產(chǎn)物與手性傳感膜的氫鍵作用更強(qiáng),L-Cys的氧化產(chǎn)物更不易從環(huán)糊精手性傳感膜表面解吸附,從而導(dǎo)致[Fe(CN)6]3-/4-在手性界面的電子傳遞受阻,體系的阻抗信號(hào)增大,因此L-Cys在環(huán)糊精基傳感器上具有更好的阻抗識(shí)別效果.

2.4 自組裝構(gòu)建環(huán)糊精基傳感器的條件優(yōu)化

在自組裝過(guò)程中,多種因素均會(huì)影響環(huán)糊精自組裝膜的結(jié)構(gòu),而手性傳感膜的性能與結(jié)構(gòu)密切相關(guān),從而能夠影響手性傳感器對(duì)L-Cys的阻抗識(shí)別效果.實(shí)驗(yàn)考察了環(huán)糊精類型、濃度、自組裝酸堿條件、溫度與時(shí)間等因素對(duì)阻抗識(shí)別L-Cys的影響.在其它條件相同時(shí),以能夠引起阻抗最大改變量的條件作為最優(yōu)條件.

2.4.1 環(huán)糊精類型的影響 根據(jù)CD含有α-1,4-D-吡喃葡萄糖單元數(shù)量的不同(6,7或8),可將其分為α-CD,β-CD和γ-CD,三者的空腔大小依次增大.通過(guò)考察L-Cys在不同環(huán)糊精構(gòu)建的傳感器中的阻抗響應(yīng),可選取最適合的手性傳感膜制備材料.實(shí)驗(yàn)分別自組裝構(gòu)建了α-CD,β-CD和γ-CD基傳感器,并對(duì)L-Cys進(jìn)行阻抗識(shí)別檢測(cè).由圖5(A)可知,L-Cys在3種傳感器中的阻抗信號(hào)均得到增強(qiáng),尤其在γ-CD基傳感器手性界面的阻抗響應(yīng)最好,ΔRet最大.這是由于具有手性位點(diǎn)的α-CD,β-CD和γ-CD均有利于L-Cys氧化產(chǎn)物的結(jié)合,但γ-CD的空腔最大,與L-Cys氧化產(chǎn)物的結(jié)合最穩(wěn)定,故阻抗響應(yīng)最好.因此,選擇γ-CD作為手性傳感膜的制備材料.

2.4.2 環(huán)糊精濃度的影響γ-CD作為主體分子,其濃度直接影響對(duì)客體分子的富集情況,自組裝過(guò)程中修飾至GCE表面的γ-CD數(shù)量與自組裝溶液的濃度有關(guān).分別采用濃度為10.0,12.5,15.0,17.5和20.0 g/L的γ-CD溶液構(gòu)建環(huán)糊精基傳感器,并對(duì)L-Cys進(jìn)行阻抗識(shí)別.圖5(B)示出了L-Cys在不同手性傳感器中的阻抗響應(yīng),阻抗信號(hào)均得到增大,當(dāng)γ-CD濃度為15.0 g/L時(shí),L-Cys的阻抗響應(yīng)最靈敏.當(dāng)γ-CD濃度低于15.0 g/L時(shí),自組裝膜較薄,L-Cys的識(shí)別位點(diǎn)較少,L-Cys的阻抗響應(yīng)也較弱; 當(dāng)γ-CD濃度高于15.0 g/L時(shí),γ-CD堆積導(dǎo)致識(shí)別位點(diǎn)數(shù)降低,L-Cys的阻抗響應(yīng)靈敏度反而降低.因此,選擇15.0 g/L為γ-CD最佳自組裝濃度.

2.4.3 自組裝pH的影響 在堿性甚至強(qiáng)堿性條件下γ-CD比較穩(wěn)定,而在酸性條件下其易部分水解生成葡萄糖和各種鏈長(zhǎng)的低聚糖[15],但該體系存在酸性環(huán)境下阻抗信號(hào)更高的特殊現(xiàn)象.實(shí)驗(yàn)考察了pH=4.00～8.00自組裝條件對(duì)傳感器定量識(shí)別L-Cys的影響,圖5(C)結(jié)果表明,在pH=5.00時(shí),L-Cys的識(shí)別效果較好且最穩(wěn)定.推測(cè)在該pH條件下,雖然犧牲了部分γ-CD的穩(wěn)定性,但弱化了L-Cys(等電點(diǎn)pH=5.02,酸性)在堿性條件下在電極膜表面的靜電排斥作用,從而在酸性條件下輸出更靈敏的電信號(hào).因此,選擇pH=5.00為最佳自組裝條件.

Fig.5 Effect of different types of CDs(A),concentrations of γ-CD(B),pH changing(C),temperature changing(D) and assembling time(E) on the γ-CD self-assembly on GCE

2.4.4 自組裝溫度的影響γ-CD在酸性條件下于100 ℃放置30 min會(huì)有一半水解,溫度可能影響組裝在玻碳電極表面的γ-CD數(shù)量、結(jié)構(gòu)狀態(tài)等,從而影響L-Cys的定量識(shí)別效果.實(shí)驗(yàn)探究了自組裝溫度分別為5,12,15,20,30及40 ℃時(shí)對(duì)L-Cys識(shí)別效果的影響.由如圖5(D)可見(jiàn),12 ℃下構(gòu)建的環(huán)糊精基傳感器對(duì)L-Cys的阻抗識(shí)別效果最好; 溫度更低時(shí),傳感器的使用壽命降低; 溫度升高時(shí),γ-CD水解能力太強(qiáng),不利于L-Cys的定量識(shí)別.因此,將12 ℃作為最優(yōu)自組裝溫度.

2.4.5 自組裝時(shí)間的影響 自組裝時(shí)間能夠影響γ-CD的組裝量和狀態(tài).組裝時(shí)間過(guò)短,手性作用位點(diǎn)不足; 自組裝時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)使γ-CD堆積,導(dǎo)致手性位點(diǎn)數(shù)量反而降低.實(shí)驗(yàn)探究了γ-CD自組裝時(shí)間分別為1.0,2.0,3.0,3.5和4.0 h時(shí)對(duì)L-Cys識(shí)別效果的影響.結(jié)果如圖5(E)所示,自組裝時(shí)間為3 h時(shí)最有利于L-Cys的定量識(shí)別; 當(dāng)組裝時(shí)間不足3 h時(shí),表面位點(diǎn)不足; 當(dāng)組裝時(shí)間超過(guò)3 h時(shí),表面γ-CD發(fā)生堆積,反而不利于L-Cys分子進(jìn)入其空腔內(nèi)部.因此,選擇自組裝時(shí)間為3 h.

2.5 環(huán)糊精自組裝膜的表征

2.5.1 環(huán)糊精自組裝膜的SEM和FTIR表征 采用SEM表征了自組裝膜的表面形貌; 通過(guò)FTIR表征分析了γ-CD自組裝至GCE表面的官能團(tuán)情況.圖6(A)為環(huán)糊精自組裝修飾后的玻碳電極放大20倍的SEM照片,可見(jiàn)γ-CD以低聚物形式附著于電極表面,自組裝手性膜內(nèi)部具有疏松多孔的結(jié)構(gòu),這可能與γ-CD分子內(nèi)部疏水、外部親水的結(jié)構(gòu)有關(guān).圖6(B)所示紅外光譜顯示,自組裝至GCE表面的γ-CD低聚物(譜線b)與γ-CD單體(譜線a)的紅外吸收峰位置基本一致,表明γ-CD在組裝過(guò)程中以氫鍵為主的分子間弱相互作用力聚集在GCE表面.SEM與FTIR表征結(jié)果均說(shuō)明γ-CD已自組裝至玻碳電極表面.

2.5.2 環(huán)糊精自組裝膜的EIS和CV表征 EIS與CV均能用來(lái)表征界面電子的傳遞情況,界面電子傳遞速率越快,則EIS的阻抗值越小,CV氧化還原峰電流越強(qiáng).為了表征γ-CD自組裝膜的電子傳導(dǎo)情況,將新構(gòu)建的環(huán)糊精基傳感器置于[Fe(CN)6]3-/4-溶液中進(jìn)行了EIS與CV測(cè)試.圖6(C)顯示[Fe(CN)6]3-/4-在環(huán)糊精基傳感器上的傳質(zhì)阻抗(28970 Ω)比在GCE表面的傳質(zhì)阻抗(2335 Ω)大的多; 圖6(D)表明,[Fe(CN)6]3-/4-在修飾傳感器界面的氧化還原峰電流信號(hào)明顯減弱.EIS與CV表征結(jié)果說(shuō)明,環(huán)糊精基傳感器的手性界面具有阻礙界面電子傳遞的作用,能夠放大[Fe(CN)6]3-/4-于界面處的傳質(zhì)阻抗信號(hào).由此推測(cè),以[Fe(CN)6]3-/4-為氧化還原探針,L-Cys在該手性傳感器中的阻抗響應(yīng)靈敏度可能比在未修飾電極中的高.

Fig.6 SEM image(A) and FTIR spectra(B) of self-assembled γ-CD,EIS(C) and CVs(D) spectra of γ-CD-based sensor and bare GCE

2.6 阻抗識(shí)別條件的優(yōu)化

磷酸鹽緩沖溶液(PBS)是常見(jiàn)的生物緩沖溶液,可用于模擬生物分子的存在環(huán)境,L-Cys與PBS緩沖液具有較好的相容性,L-Cys在中性條件下即可實(shí)現(xiàn)電氧化過(guò)程[17],因此,選擇pH=7.00的PBS緩沖液作為L(zhǎng)-Cys電氧化過(guò)程的支持電解質(zhì).另外,[Fe(CN)6]3-/4-在含有0.1 mol/L KCl的pH=7.00 PBS緩沖液中阻抗響應(yīng)較穩(wěn)定,故以此溶液作為阻抗測(cè)試的支持電解質(zhì).在此基礎(chǔ)上,分別考察了L-Cys的電氧化方式以及[Fe(CN)6]3-/4-濃度對(duì)阻抗識(shí)別L-Cys的影響.

Fig.7 Effect of different means(A) and concentrations of [Fe(CN)6]3-/4-(B) on the γ-CD-based sensor(A) a.DPV,0—1.0 V; b.stewing 65 s; c.CV,0—1.0 V.

2.6.1L-Cys電氧化方式的影響L-Cys的電氧化過(guò)程是其在傳感器中阻抗識(shí)別的關(guān)鍵步驟,選擇合適的電氧化方式有利于提高阻抗響應(yīng)的靈敏度.在相同條件下分別構(gòu)建了3組環(huán)糊精基傳感器,第一組手性傳感器在含有L-Cys的pH=7.00 PBS緩沖液中施加DPV氧化信號(hào)后,測(cè)試EIS信號(hào); 第二組手性傳感器在相同的溶液中放置65 s后,測(cè)試EIS信號(hào); 第三組手性傳感器在相同的溶液中施加CV信號(hào)后,測(cè)試EIS信號(hào).比較3種電氧化方式的阻抗變化[圖7(A)]發(fā)現(xiàn),傳感器先掃描DPV,再測(cè)試EIS,L-Cys的阻抗響應(yīng)最靈敏.這可能是由于DPV氧化信號(hào)使L-Cys發(fā)生電氧化,其電氧化產(chǎn)物與γ-CD以主客體作用形成穩(wěn)定的超分子體系,而CV電化學(xué)過(guò)程可能還改變了該超分子體系的其它性質(zhì).因此,電氧化方式以DPV為最佳.

2.6.2 [Fe(CN)6]3-/4-濃度的影響 手性傳感膜界面的電子傳遞速率與[Fe(CN)6]3-/4-的濃度相關(guān),因此選擇合適的[Fe(CN)6]3-/4-濃度有利于提高L-Cys阻抗識(shí)別的靈敏度.分別選取1.0×10-4,2.0×10-4,3.0×10-4,5.0×10-4和1.0×10-3mol/L [Fe(CN)6]3-/4-作為探針溶液,測(cè)試了手性傳感器在其中的電化學(xué)阻抗響應(yīng)情況.由圖7(B)可知,在[Fe(CN)6]3-/4-濃度達(dá)到2.0×10-4mol/L之前,隨著其濃度的遞減L-Cys的阻抗增大,更有利于L-Cys的定量識(shí)別; 當(dāng)[Fe(CN)6]3-/4-濃度低至2.0×10-4mol/L時(shí),L-Cys的阻抗識(shí)別效果最好; 之后,進(jìn)一步降低[Fe(CN)6]3-/4-濃度反而使阻抗譜擬合度變差,定量識(shí)別效果不佳.因此,選擇2.0×10-4mol/L [Fe(CN)6]3-/4-作為最優(yōu)測(cè)試條件.

2.7 環(huán)糊精基傳感器對(duì)L-半胱氨酸的阻抗識(shí)別性能

2.7.1 工作曲線 在最佳條件下構(gòu)建了環(huán)糊精基傳感器,并以最優(yōu)測(cè)試條件考察了阻抗值與L-Cys濃度之間的關(guān)系.結(jié)果表明,L-Cys在環(huán)糊精基傳感器中的電化學(xué)阻抗值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.986%(n=10),具有良好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性.圖8(A)和(B)表明,L-Cys濃度在0.1～1.0 μmol/L及1.0～6.0 μmol/L范圍內(nèi),ΔR與L-Cys濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性回歸方程分別為ΔR1=4127c+1947(R2=0.9154)和ΔR2=345.3c+5490(R2=0.9908); 檢出限(LOD)為74 nmol/L(S/N=3).

圖8(C)示出了L-Cys濃度在0.1～1.0 μmol/L范圍內(nèi),L-Cys分別在環(huán)糊精基傳感器和未修飾電極上阻抗響應(yīng)的線性關(guān)系對(duì)比圖,可見(jiàn),L-Cys在環(huán)糊精基傳感器中的阻抗識(shí)別靈敏度更高,是在未修飾電極上阻抗識(shí)別靈敏度的近20倍.

Fig.8 EIS(A) and calibration curve(B) for the detection of L-Cys with 0.1—6.0 μmol/L on γ-CD-based sensor and the comparison(C) of calibration curves for L-Cys on γ-CD-based sensor or bare GCE

Fig.9 Impedance responses(A) of various structural analogues on γ-CD-based sensor and selectivity analysis(B) for detection of L-Cys on γ-CD-based sensor and bare GCE

2.7.2 特異識(shí)別性 選擇性是衡量傳感器特異性的一個(gè)重要指標(biāo).實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究D-Cys,Hcy和L/D-Pen在環(huán)糊精基傳感器上的阻抗識(shí)別效果,考察了該傳感器的選擇性,并與L-Cys在未修飾電極上阻抗識(shí)別的選擇性系數(shù)進(jìn)行對(duì)比.如圖9(A)所示,幾種含巰基物質(zhì)均可以使傳感器的阻抗信號(hào)增大,但有所差異.圖9(B)與表2比較了不同方法對(duì)不同結(jié)構(gòu)相似物的阻抗響應(yīng)情況,可見(jiàn)環(huán)糊精基傳感器對(duì)幾種物質(zhì)的選擇性系數(shù)均比未修飾電極增大.

在特異性研究中,對(duì)D-Cys的阻抗識(shí)別效果僅次于L-Cys,未修飾電極對(duì)D-Cys的選擇性系數(shù)為1.179,但環(huán)糊精基傳感器對(duì)該物質(zhì)的選擇性系數(shù)為2.301,手性選擇性提高了約1倍.據(jù)此推測(cè),由于存在分子內(nèi)氫鍵作用,L-Cys氧化產(chǎn)物與自組裝γ-CD手性傳感膜的結(jié)合更牢固,從而使[Fe(CN)6]3-/4-在手性傳感器界面的電子傳遞受阻更嚴(yán)重,導(dǎo)致阻抗信號(hào)改變明顯,與未修飾電極相比,選擇性系數(shù)提升了近1倍.另外,通過(guò)分析L/D-Pen的阻抗響應(yīng),發(fā)現(xiàn)該手性傳感器對(duì)L-Pen的阻抗識(shí)別效果比D-Pen的效果更好,這與L/D-Cys的阻抗識(shí)別的手性規(guī)律一致,說(shuō)明自組裝γ-CD手性傳感膜具有對(duì)L構(gòu)型的手性分子更匹配的手性識(shí)別位點(diǎn).手性傳感器對(duì)Hcy的識(shí)別效果比未修飾電極的識(shí)別效果略有增強(qiáng),推測(cè)是由于環(huán)糊精與Hcy之間形成了氫鍵,識(shí)別過(guò)程中氫鍵作用使相關(guān)氨基酸較易吸附于電極表面.

Table 2 Selectivity coefficients of various structuralanalogues on γ-CD-based sensor

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了人體血清和舒邦膠囊中的L-Cys含量[19],用新構(gòu)建的傳感器采用加標(biāo)回收法測(cè)定回收率.結(jié)果如表3所示,該傳感器對(duì)人體血清中L-Cys含量測(cè)定的平均回收率在98.9%～108%之間(n=3),而對(duì)舒邦膠囊中L-Cys檢測(cè)的平均回收率在88.9%～90.6%之間(n=3).可見(jiàn),該傳感器在實(shí)際樣品的復(fù)雜體系中對(duì)L-Cys的檢測(cè)結(jié)果切實(shí)可靠.

Table 3 Detection of L-Cys in different real samples

3 結(jié) 論

基于自組裝技術(shù)構(gòu)建了環(huán)糊精基阻抗型傳感器,運(yùn)用電化學(xué)阻抗法實(shí)現(xiàn)了L-Cys的快速定量檢測(cè).利用量子化學(xué)模擬推演了針對(duì)D/L-Cys的電化學(xué)傳感機(jī)制,通過(guò)模擬數(shù)據(jù)獲得L-Cys氧化產(chǎn)物與環(huán)糊精基手性傳感膜之間的弱相互作用能為-12.6 eV,最強(qiáng)氫鍵鍵長(zhǎng)為103 pm,鍵價(jià)為0.69,且與其異構(gòu)體存在差異.參考模擬結(jié)果對(duì)L-Cys進(jìn)行了實(shí)際電化學(xué)阻抗分析,在0.1～1.0 μmol/L濃度范圍內(nèi)高靈敏檢出L-Cys,檢出限達(dá)到74 nmol/L(S/N=3),實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模擬數(shù)據(jù)相吻合.該電分析方法操作簡(jiǎn)便、成本低廉、電極易于制備、測(cè)試重現(xiàn)性好且實(shí)際樣品檢出結(jié)果穩(wěn)定.本文基于模擬分析篩選弱電活性手性化合物,高效構(gòu)建了新型電化學(xué)傳感器,為電化學(xué)手性識(shí)別機(jī)制的拓展提供了新思路.