李立佳 符梅竹 黃惠敏 鄭詩(shī)華 閻青青 張曉鈿

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科，海口 570102)

血管瘤是嬰幼兒常見(jiàn)的良性腫瘤，多發(fā)于面頸部、四肢、口腔黏膜、肌肉、肝臟等[1]。隨著年齡逐漸增長(zhǎng)，部分患兒的血管瘤可自行消退，而另外一部分患兒的血管瘤則不斷增殖，影響患兒的外貌和身心健康[2]。當(dāng)前，血管瘤通常采用激光手術(shù)和藥物等方式進(jìn)行治療，而其發(fā)病和消退機(jī)制尚不完全清楚。

Toonaciliatin A是一種檸檬苦素類(lèi)似物，研究發(fā)現(xiàn)其能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[3,4]。T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因(T lymphoma invasion and metastasis inducing gene 1,Tiam1)是從小鼠T淋巴瘤細(xì)胞系中克隆出來(lái)的，在人類(lèi)多種腫瘤細(xì)胞系中異常表達(dá)，與細(xì)胞的增殖、凋亡等過(guò)程密切相關(guān)[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)，Tiam1在血管瘤增生期表達(dá)上調(diào)，與血管瘤增殖有關(guān)[8]。VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在血管瘤發(fā)展中發(fā)揮作用，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和其受體VEGFR2在此通路中起重要作用[9]。VEGF及其受體在增生期的血管瘤標(biāo)本中表達(dá)顯著上調(diào)，與血管瘤的增殖密切相關(guān)[10]。

本課題以分離所得的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(hemangioma-derived endothelial cells,HemEC)為研究對(duì)象，采用不同濃度檸檬苦素類(lèi)似物Toonaciliatin A處理HemEC，研究Toonaciliatin A對(duì)HemEC細(xì)胞增殖和凋亡的影響，及Tiam1基因和VEGF信號(hào)通路在此機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HemEC)由分離所得；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Gibco公司，檸檬苦素類(lèi)似物Toonaciliatin A購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司；pcDNA-Tiam1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)組連接后測(cè)序驗(yàn)證；雙抗、兔抗人第Ⅷ凝血因子抗體抗原、抗Tiam1抗體、抗VEGF抗體、抗VEGFR2抗體和抗β-actin抗體購(gòu)自Abcam公司；胰蛋白酶Trypsin、膠原酶(collagenase)A、四氮唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞礬(dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；Total RNA提取試劑盒、 Real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司，顯微鏡、全自動(dòng)酶標(biāo)儀及Real-time PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞分離和培養(yǎng)[11]血管瘤標(biāo)本取自海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院一女性患兒，年齡6個(gè)月，瘤體長(zhǎng)勢(shì)快。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容經(jīng)患者監(jiān)護(hù)人同意，并簽訂知情同意書(shū)。

將血管瘤標(biāo)本用PBS緩沖液清洗3遍，然后剪碎(<1 mm3)，加入3倍體積的膠原酶A(0.2%)，37℃孵育1 h，將勻漿化的組織經(jīng)100 μmol/L細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾，加入NH4Cl溶解紅細(xì)胞。然后再經(jīng)40 μmol/L 細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾，獲得單細(xì)胞懸液。接種于含20% FBS、1% 青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至融合度90%左右，傳代培養(yǎng)，傳代至第3代后即可獲取較純的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HemEC)，細(xì)胞鑒定存在第Ⅷ凝血因子相關(guān)抗原對(duì)其進(jìn)行鑒定。待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h進(jìn)行同步化處理，然后加入檸檬苦素類(lèi)似物Toonaciliatin A(0、20、40、80 μg/ml)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 待HemEC細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，稀釋為1×106個(gè)/ml，以每孔200 μl接種于6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。先用無(wú)血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、pcDNA和pcDNA-Tiam1(將Tiam1 cDNA插入pcDNA載體后測(cè)序驗(yàn)證)，之后取等體積脂質(zhì)體和載體混合，輕輕混勻，室溫孵育20 min，加入到培養(yǎng)好的細(xì)胞孔板中，混勻后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)6 h，換成完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3Real-time PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 將Toonaciliatin A處理或轉(zhuǎn)染48 h的各組HemEC細(xì)胞進(jìn)行收集，按照Total RNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)提取總RNA，測(cè)定濃度和純度后于-80℃保存。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，反應(yīng)程序?yàn)?2℃45 min、70℃10 min；4℃放置10 min，合成的cDNA按照Real-time PCR的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 45 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。Tiam1 上游引物 5′-AAGACGTACTCAGGCCATGTCC-3 ′，下游引物 5 ′-GACCCAAATGTCGCAGTCAG-3′；VEGF 上游引物 5′-TTGACTGCTGTGGACTTGAG-3 ′，下游引物 5 ′-AGGACATAGGTCCTTTTAGG-3′；VEGFR2上游引物 5′-CCTACAAGTGCTTCTACCG-3′，下游引物 5 ′-TCAATCCCCACATTTAGTT-3′。運(yùn)用Bio-Rad PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，經(jīng)內(nèi)參照β-actin進(jìn)行校正。

1.2.4MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞生存率 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HemEC細(xì)胞進(jìn)行收集，分別加入終濃度為0、20、40、80 μg/ml的Toonaciliatin A后，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，加入 20 μl(5 g/L)MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO溶解甲瓚結(jié)晶，室溫振蕩5 min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD492 nm 處的吸光度(A)值，按照公式生存率(%)=實(shí)驗(yàn)組A均值/control組A均值×100%，計(jì)算生存率。找出半數(shù)抑制濃度最佳條件。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率 各組HemEC細(xì)胞經(jīng)Toonaciliatin A處理后，以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后棄去培養(yǎng)液，胰酶消化，收集細(xì)胞，按照 Annexin V/PI 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，加入 200 μl binding buffer重懸細(xì)胞，再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl 碘化丙啶(PI)混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

1.2.6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 將轉(zhuǎn)染后經(jīng) Toonaciliatin A處理并培養(yǎng)48 h的各組HemEC細(xì)胞(對(duì)照組、檸檬苦素組、檸檬苦素+pcDNA組、檸檬苦素+pcDNA-Tiam1組)進(jìn)行收集，加入RIPA 重懸細(xì)胞，冰浴超聲破碎收集蛋白，測(cè)定總蛋白濃度。每個(gè)樣本進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗(抗Tiam1 1∶500、抗VEGF抗體 1∶1 000 或抗VEGFR2 1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜2次，加入1 000倍稀釋的二抗，室溫孵育1 h，以β-actin為內(nèi)參照，分析蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1Toonaciliatin A對(duì)人體血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HemEC)活性的影響 正常培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HemEC)見(jiàn)圖1。

本文根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)；最終選用Toonaciliatin A致HemEC細(xì)胞存活率在50%附近的3個(gè)濃度(20、40、80 μg/ml)進(jìn)行試驗(yàn)。

Toonaciliatin A處理人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HemEC)24 h、48 h、72 h，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與control組相比，20 μg/ml組、40 μg/ml組、80 μg/ml組在24 h、48 h、72 h細(xì)胞生存率顯著下降(P<0.05)；與20 μg/ml組相比，40 μg/ml組、80 μg/ml組在24 h、48 h、72 h細(xì)胞生存率顯著下降(P<0.05)；與40 μg/ml組相比，80 μg/ml組在24 h、48 h、72 h細(xì)胞生存率顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2。說(shuō)明Toonaciliatin A能夠抑制HemEC增殖。

2.2Toonaciliatin A對(duì)人體血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖3、表1)，與control組相比，20 μg/ml組、40 μg/ml組、80 μg/ml組細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；與20 μg/ml組相比，40 μg/ml組、80 μg/ml組細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)；與40 μg/ml組相比，80 μg/ml組細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)。說(shuō)明Toonaciliatin A能夠促進(jìn)HemEC凋亡。

2.3Toonaciliatin A對(duì)人體血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞Tiam1蛋白表達(dá)的影響 qRT-PCR和Western blot結(jié)果均顯示，與control組相比，20 μg/ml組、40 μg/ml組、80 μg/ml組Tiam1表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；與20 μg/ml組相比，40 μg/ml組、80 μg/ml組Tiam1表達(dá)量顯著下降(P<0.05)； 與40 μg/ml組相比，80 μg/ml組Tiam1表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖4和表2。說(shuō)明Toonaciliatin A能夠抑制Tiam1蛋白表達(dá)。

圖1 正常培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞Fig.1 Normally cultured hemangioma endothelial cells

圖2 Toonaciliatin A抑制人體血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞活性Fig.2 Toonaciliatin A inhibited cell viability of HemECNote: *.P PP

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)檢測(cè)人體血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡Fig.3 Apoptosis of HemEC was detected by flow cytometry

GroupsCell apoptosis(%)Control5.85±0.4520 μg/ml13.88±1.071)40 μg/ml21.29±2.831)2)80 μg/ml26.42±3.111)2)3)F50.686P0.000

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs 20 μg/ml group;3)P<0.05 vs 40 μg/ml group.

圖4 檢測(cè)人體血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞Tiam1蛋白表達(dá)Fig.4 Expression levels of Tiam1 protein in HemEC

GroupsTiam1 mRNATiam1 proteinControl4.63±0.050.63±0.0920 μg/ml3.37±0.041)0.39±0.051)40 μg/ml1.71±0.181)2)0.25±0.031)2)80 μg/ml1.15±0.111)2)3)0.14±0.031)2)3)F621.85243.250P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs 20 μg/ml group;3)P<0.05 vs 40 μg/ml group.

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取處理時(shí)間48 h，抑制率為50%左右的Toonaciliatin A濃度(40 μg/ml)用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4過(guò)表達(dá)Tiam1 逆轉(zhuǎn)Toonaciliatin A對(duì)HemEC的抑制作用 Western blot、流式細(xì)胞術(shù)和MTT結(jié)果顯示，與control組相比，40 μg/ml組Tiam1表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，HemEC細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，在24 h、48 h、72 h細(xì)胞生存率顯著下降(P<0.05)；與pcDNA組相比，pcDNA-Tiam1組Tiam1表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，HemEC細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，在24 h、48 h、72 h細(xì)胞生存率顯著上升(P<0.05)；與40 μg/ml+pcDNA組相比，40 μg/ml+pcDNA-Tiam1組Tiam1表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)，在24 h、48 h、72 h細(xì)胞生存率顯著上升(P<0.05)，見(jiàn)圖5和表4。說(shuō)明過(guò)表達(dá)Tiam1逆轉(zhuǎn)了Toonaciliatin A對(duì)HemEC的抑制作用。

圖5 檢測(cè)人體血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞Tiam1蛋白表達(dá)Fig.5 Expression levels of Tiam1 protein in HemECNote: *.P PP

GroupsTiam1 proteinApoptosis rate(%)Control0.63±0.066.18±0.7440 μg/ml0.26±0.031)22.46±1.681)pcDNA0.58±0.068.56±0.55pcDNA-Tiam10.84±0.082)3.29±0.342)40 μg/ml+pcDNA0.23±0.0224.29±2.4340 μg/ml+pcDNA-Tiam10.48±0.053)12.16±2.533)F55.80784.550P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs pcDNA group;3)P<0.05 vs 40 μg/ml+pcDNA group.

2.5過(guò)表達(dá)Tiam1逆轉(zhuǎn)了Toonaciliatin A對(duì)人HemEC細(xì)胞VEGF/VEGFR2通路的影響 Western blot結(jié)果表明，與control組相比，40 μg/ml組VEGF和VEGFR2蛋白表達(dá)量均顯著下降(P<0.05)； 與pcDNA組相比，pcDNA-Tiam1組VEGF和VEGFR2蛋白表達(dá)量均顯著上升(P<0.05)；與40 μg/ml+pcDNA組相比，40 μg/ml+pcDNA-Tiam1組VEGF和VEGFR2蛋白表達(dá)量均顯著上升(P<0.05)，見(jiàn)圖6和表5。說(shuō)明Toonaciliatin A能夠抑制VEGF和VEGFR2蛋白表達(dá)，過(guò)表達(dá)Tiam1逆轉(zhuǎn)了Toonacili-atin A對(duì)VEGF和VEGFR2蛋白表達(dá)的抑制作用。加大Toonaciliatin A的用量會(huì)對(duì)HemEC細(xì)胞存活影響較大，對(duì)VEGF/VEGFR2通路的影響也較大，過(guò)表達(dá)Tiam1便不能恢復(fù)。

圖6 檢測(cè)人體血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGF/VEGFR2通路蛋白表達(dá)Fig.6 Expression levels of VEGF/VEGFR2 pathway proteins in HemEC

GroupsVEGF proteinVEGFR2 proteinControl0.85±0.090.57±0.0640 μg/ml0.39±0.041)0.22±0.041)pcDNA0.72±0.070.48±0.05pcDNA-Tiam10.89±0.092)0.63±0.062)40 μg/ml+pcDNA0.41±0.030.23±0.0440 μg/ml+pcDNA-Tiam10.66±0.083)0.41±0.053)F27.32834.208P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs control group;2)P<0.05 vs pcDNA group;3)P<0.05 vs 40 μg/ml+pcDNA group.

3 討論

早產(chǎn)、低體重、絨毛膜取樣、孕期癲癇等因素會(huì)提高新生兒血管瘤的發(fā)生率[1,12]。血管瘤通常在嬰兒出生后1周左右出現(xiàn)，在1歲內(nèi)快速增殖，1歲左右逐漸消退，70%的患兒在7歲時(shí)都可消退，少部分繼續(xù)增殖面積變大需治療。血管瘤消退后可能出現(xiàn)瘢痕、萎縮、色素減退、血管擴(kuò)張或皮膚松弛等癥狀，影響容貌，給患者及家屬帶來(lái)很大的心理創(chuàng)傷[2,13]。

檸檬苦素是引起柑橘苦味的重要物質(zhì)，具有抗腫瘤增殖、抗菌性、鎮(zhèn)痛消炎等作用[14,15]。Toonaciliatin A是一種檸檬苦素類(lèi)似物，提取自思茅紅椿(Toonaciliata Roem.var.henryi)[3]。丁怡等[4]研究表明，Toonaciliatin A能夠抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，Toonaciliatin A能夠抑制HemEC增殖，促進(jìn)HemEC細(xì)胞凋亡，證實(shí)了Toonaciliatin A的腫瘤抑制作用。

Tiam1蛋白是鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)換因子GEF家族成員之一，可以特異性激活Rho GTPase家族中的Rac1，在乳腺癌、膀胱癌、肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力有關(guān)[16]。Liu等[17]發(fā)現(xiàn)，Tiam1通過(guò)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)EMT促進(jìn)甲狀腺癌轉(zhuǎn)移。丁軼[18]發(fā)現(xiàn)Tiam1在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在肝硬化組織中低表達(dá)，在正常肝組織中不表達(dá)，沉默Tiam1可抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。劉涓等[8]研究表明，Tiam1在血管瘤細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，對(duì)血管瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果表明，Toonaciliatin A抑制Tiam1蛋白表達(dá)，過(guò)表達(dá)Tiam1則逆轉(zhuǎn)了Toonaciliatin A對(duì)HemEC的抑制作用，說(shuō)明Toonaciliatin A通過(guò)抑制Tiam1表達(dá)進(jìn)而抑制血管瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

VEGF是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，其主要靶細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞，選擇性刺激內(nèi)皮細(xì)胞分裂，增加微血管通透性，改變細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)毛細(xì)血管穿透侵入組織內(nèi)。VEGFR2是VEGF的受體2，通常低表達(dá)于正常組織的內(nèi)皮細(xì)胞上。VEGF在腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞及增生期血管瘤中高表達(dá)，VEGFR2高表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞[9,19]，抗VEGF/VEGFR用于腫瘤治療[20]。Wu等[21]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，沉默Tiam1會(huì)抑制VEGF表達(dá)，Tiam1通過(guò)VEGF、ERK和AP-1途徑促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移。王啟船等[22]發(fā)現(xiàn)Tiam1和VEGF在食管鱗癌中高表達(dá)，兩者可能促進(jìn)食管鱗癌血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)Toonaciliatin A能夠抑制HemEC細(xì)胞中VEGF和VEGFR2蛋白表達(dá)，過(guò)表達(dá)Tiam1則會(huì)逆轉(zhuǎn)Toonaciliatin A對(duì)VEGF和VEGFR2蛋白表達(dá)的抑制作用。說(shuō)明Toonaciliatin A通過(guò)靶向Tiam1抑制HemEC細(xì)胞中VEGF/VEGFR2通路蛋白的表達(dá)，間接證實(shí)了Tiam1與VEGF/VEGFR2通路存在調(diào)控關(guān)系。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，加大Toonaciliatin A的用量會(huì)對(duì)HemEC細(xì)胞存活影響較大，對(duì)VEGF/VEGFR2通路的影響也較大，過(guò)表達(dá)Tiam1便不能恢復(fù)。

本研究首次闡述在HemEC細(xì)胞中檸檬苦素類(lèi)似物Toonaciliatin A靶向Tiam1基因抑制VEGF/VEGFR2通路蛋白表達(dá)，從而抑制HemEC細(xì)胞增殖，促進(jìn)HemEC細(xì)胞凋亡。檸檬苦素對(duì)人血管瘤具有潛在治療作用，本研究為人血管瘤的診斷和治療提供新的思路，對(duì)血管瘤發(fā)生、增殖和消退機(jī)制的基礎(chǔ)研究具有重要意義。