尹潤龍 尹東亮 盧沛林 李柱威 林志強

(東莞市人民醫(yī)院肝膽外科，東莞 523059)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球范圍內(nèi)第五大常見癌癥和癌癥相關(guān)性死亡的第三大原因[1]。HCC約占原發(fā)性肝癌的90%，每年約有100萬人罹患HCC，且已成為全球性的健康問題[2]。盡管外科手術(shù)在過去的幾十年里取得了較大進步，但HCC患者仍面臨較高的術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的發(fā)生率[3]。因此，探討HCC發(fā)生發(fā)展的分子機制并尋求新的治療措施已成為國內(nèi)外科研人員的熱議話題。越來越多的證據(jù)表明，癌癥的轉(zhuǎn)移是由處于浸潤期的原發(fā)性癌癥的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)特性所介導(dǎo)的[4,5]。而EMT被認(rèn)為是由細胞因子[6]、轉(zhuǎn)化因子[7]和其他因素[8,9]所誘導(dǎo)的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟。Wnt/β-catenin信號通路能夠調(diào)控原胚腸形成、心臟瓣膜形成甚至是癌癥發(fā)生過程中的EMT[10,11]。激活Wnt/β-catenin通路在胃癌的EMT過程中扮演重要作用[12]。配對相關(guān)同源框1(paired-related homoeobox 1，PRRX1)是最近被確認(rèn)的一種新的EMT誘導(dǎo)物[13]。臨床研究表明，PRRX1的異常表達與多種實體腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)；高表達的PRRX1與乳腺癌的低轉(zhuǎn)移率和良好預(yù)后顯著相關(guān)[14]，而在結(jié)直腸癌和胃癌中卻觀察到相反的關(guān)系[15，16]。此外，下調(diào)PRRX1的表達能通過獲取腫瘤干細胞樣屬性促進乳腺癌和HCC患者的不良預(yù)后[14,17]。因此，我們推測上調(diào)PRRX1的表達極有可能通過Wnt/β-catenin途徑參與肝癌細胞的生物學(xué)習(xí)性的調(diào)控。而本研究著重研究PRRX1過表達對肝癌細胞株SMMC-7721體內(nèi)致瘤性的影響，并聯(lián)合Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939進行干預(yù)，探索Wnt/β-catenin信號通路在PRRX1介導(dǎo)的肝癌細胞致瘤性改變中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞株SMMC-7721及HEK293細胞購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所細胞庫；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Gibco公司；青霉素、鏈霉素購自上海拜力生物科技有限公司；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；Wnt/β-catenin信號通路抑制劑XAV939購自美國Med Chem Express公司；全蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白定量測定試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒及原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP nick end labeling，TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Ki-67細胞增殖檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；超敏電化學(xué)發(fā)光(electrochemical lumines-cence，ECL)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；山羊抗人PRRX1多克隆抗體、兔抗人β-連環(huán)蛋白(β-catenin)多克隆抗體、兔抗人原癌基因(c-Myc)單克隆抗體以及兔抗人β-actin多克隆抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的兔抗山羊IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；5～6周齡雌性BALB/c裸鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司；光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品；輪轉(zhuǎn)式切片機為杭州艾普儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；全自動數(shù)碼凝膠成像儀為上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1HEK293T細胞的培養(yǎng)及PRRX1重組慢病毒的制備 將HEK293T細胞置于含有100 ml/L FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。本實驗中PRRX1重組慢病毒質(zhì)粒pLV-PRRX1-IRES2-EGFP及空載重組質(zhì)粒pLV-CON-IRES2-EGFP的構(gòu)建及鑒定由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成；轉(zhuǎn)染前，取生長狀態(tài)良好的處于對數(shù)生長期的HEK293T細胞，提前2 d接種于培養(yǎng)皿中。取5 μg PRRX1重組慢病毒質(zhì)粒、5 μg輔助質(zhì)粒與相應(yīng)體積的Opti-MEM混合均勻，總體積為2.5 ml，于室溫下孵育5 min，以空載重組質(zhì)粒作陰性對照。取100 μl LipofectamineTM2000與2.4 ml Opti-MEM混合，室溫孵育5 min。再將兩種Opti-MEM混合液混合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞。轉(zhuǎn)染12 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細胞上清液，離心、過濾。上清液于4℃、25 000 r/min條件下離心2 h，所獲病毒分別命名為LV-PRRX1和LV-CON，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2慢病毒滴度的測定 測定前一天，在24孔板中接種HEK293T細胞，每孔接種約5.0×104個細胞加入100 μl含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞融合度達到30%左右時，吸棄24孔板中原有的培養(yǎng)液，將包裝后收集的病毒上清液進行梯度稀釋(10-1～10-7)后分別滴加到24孔板內(nèi)，其中第一個EP管稀釋10-1，即10 μl 病毒液+90 μl含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液；第二個EP管所得病毒原液為第一個EP管的1/10；依次類推，第七個EP管所得病毒原液為第六個EP管的1/10。將每個EP管中溶液混勻后滴加到24孔板中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后加入100 μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后，在顯微鏡下觀察，計算最后兩個孔GFP熒光陽性細胞數(shù)，其中第六孔熒光細胞數(shù)目記為A，第七孔熒光細胞數(shù)目記為B。按下式計算病毒滴度：病毒滴度(TU/L)=(A+B×10)×103/2/第六孔的病毒液的含量(μl)×103。所得結(jié)果為：LV-PRRX1(病毒滴度)=2.5×1010U/L；LV-CON(病毒滴度)=4×1010U/L。

1.2.3SMMC-7721細胞培養(yǎng)及慢病毒感染 將SMMC-7721細胞置于含有100 ml/L FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。取生長處于對數(shù)期的SMMC-7721細胞，制成單細胞懸液按每孔1.0×105個接種于24孔板中，待細胞融合達50%時，予以慢病毒LV-PRRX1和LV-CON均以感染復(fù)數(shù)(MOI)為100分別感染細胞(即兩種慢病毒用量均為1.0×105×MOI=107TU，按上述1.2.2病毒滴度測定結(jié)果換算成體積為：VLV-PRRX1=107U/2.5×1010U/L=0.4 ml；VLV-CON=107U/4×1010U/L=0.25 ml)，同時設(shè)置正常培養(yǎng)的細胞為空白對照組。病毒感染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。5 d后，在熒光顯微鏡下觀察各組細胞GFP的表達情況，并采用Western blot檢測各組細胞PRRX1的表達。

1.2.4裸鼠皮下移植瘤模型的構(gòu)建及實驗分組 分別取對數(shù)生長期的對照組、LV-CON組和LV-PRRX1組SMMC-7721細胞制備成細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)至2×106個/ml，后注射于裸鼠右側(cè)背部皮下(劑量：0.2 ml/只)；其中對照組、LV-CON組每組10只，LV-PRRX1組20只。約1周后，待實驗裸鼠接種部位長出肉眼可見腫瘤(腫瘤直徑約0.5 cm)時，選取對照組和LV-CON組裸鼠各5只，LV-PRRX1組10只進行干預(yù)治療。其中LV-PRRX1組裸鼠又隨機分為2組：LV-PRRX1組及LV-PRRX1+XAV939處理組(n=5)。治療時，對照組、LV-CON組及LV-PRRX1組每只裸鼠均行0.2 ml生理鹽水腫瘤處注射；而LV-PRRX1+XAV939處理組每只裸鼠行0.2 ml XAV939生理鹽水注射液(XAV939濃度：0.25 mg/ml)腫瘤處注射，每周2次；連續(xù)治療4周。治療期間密切觀察裸鼠的生存狀態(tài)，從治療當(dāng)天起，每4 d測量1次瘤體，瘤體計算公式為：V=L×W2/2(L：瘤體長度；W：瘤體寬度)。末次測量后，裸鼠脫臼處死，切除腫瘤并拍照。后將每組一部分腫瘤保存在4%多聚甲醛中固定，另一部分-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5HE染色觀察瘤體組織病理變化 取固定了48 h的各組裸鼠瘤體標(biāo)本，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制作病理切片(厚度3 μm)。將石蠟切片依次再經(jīng)脫蠟、蘇木精染色、分化以及藍化后伊紅染色、洗滌脫水以及透明后封片。光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.2.6TUNEL染色檢測瘤體組織細胞凋亡 將制作好的瘤體石蠟切片(厚度5 μm)依次進行TUNEL染色處理：烤片和脫蠟；水化；蛋白酶K工作液常溫孵育15～30 min；滴加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液于樣品上，在濕盒、暗室中37℃避光孵育60 min；用PBS沖洗3次；加入50 μl轉(zhuǎn)化劑-POD于樣品上，在濕盒中37℃避光孵育30 min；用PBS沖洗3次；加入100 μl DAB底物，于25℃孵育10 min；用PBS沖洗3次；蘇木素復(fù)染、脫水、透明；封片，光鏡下觀察；陽性結(jié)果判斷：陽性染色的細胞核染成棕褐色，為凋亡細胞。隨機選擇3個視野，觀察凋亡細胞并計算凋亡率。

1.2.7免疫組化檢測瘤體組織Ki-67表達 根據(jù)試劑盒操作，將制作好的瘤體石蠟切片(厚度5 μm)依次進行Ki-67染色處理：將制備的組織用檸檬酸緩沖液(pH=6)處理20 min進行抗原修復(fù)；然后，將組織置于3% H2O2中，常溫加濕室中10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，再用PBS沖洗3次；加入兔抗人Ki-67一抗(稀釋比1∶500)在4℃下，孵育過夜；然后滴加即用型HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶500)室溫孵育30 min；DAB顯色后蘇木精復(fù)染3 min。著色后，用梯度乙醇(75%、85%、95%、100%)和二甲苯脫水，用中性樹脂固定、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察Ki-67陽性細胞并統(tǒng)計陽性率。

1.2.8Western blot檢測瘤體組織蛋白表達 取-80℃凍存的各組細胞或瘤體組織，分別進行全蛋白提取，后進行濃度檢測；取20 μg蛋白和4 μl 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分別加入一抗(PRRX1，1∶1 000；β-catenin，1∶1 000；c-Myc，1∶800；β-actin，1∶1 500)在4℃下，孵育過夜；PBS洗膜；加入HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG二抗(1∶2 500)或羊抗兔IgG二抗(1∶2 500)室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用ECL化學(xué)發(fā)光進行顯色。以β-actin為內(nèi)參蛋白，采用Quantity One圖像處理軟件對各指標(biāo)灰度值進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1LV-PRRX1慢病毒感染促進了SMMC-7721細胞PRRX1蛋白表達 Western blot檢測各感染組SMMC-7721細胞中PRRX1蛋白的表達情況。與正常對照組比較，LV-CON組細胞PRRX1蛋白水平無顯著差異；與LV-CON組比較，LV-PRRX1組細胞PRRX1蛋白水平顯著增加(P<0.05，圖1)。說明PRRX1過表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)SMMC-7721細胞株構(gòu)建成功。

2.2PRRX1過表達抑制了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤的生長 采用生理鹽水或XAV939對移植瘤進行干預(yù)并繪制移植瘤生長曲線。與正常對照組比較，LV-CON組裸鼠移植瘤生長速度無顯著差異(圖2)；從治療12 d起，與LV-CON組比較，LV-PRRX1組裸鼠移植瘤體積顯著降低(P<0.05)，腫瘤生長緩慢；從治療20 d起，與LV-PRRX1組比較，LV-PRRX1聯(lián)合XAV939組裸鼠移植瘤體積顯著降低(P<0.05)，腫瘤生長進一步減慢；治療28 d取樣結(jié)果顯示，LV-PRRX1組裸鼠移植瘤體積顯著低于LV-CON組，而與LV-PRRX1組比較，LV-PRRX1聯(lián)合XAV939組裸鼠移植瘤體積更小。提示PRRX1過表達顯著抑制SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤的生長，且XAV939對這一效應(yīng)具有一定的促進作用。

圖1 Western blot檢測各組細胞中PRRX1蛋白表達Fig.1 Protein expression of PRRX1 in each group was tested by Western blotNote:1.Control group；2.LV-CON group；3.LV-PRRX1 group.Com-pared with LV-CON group，*.P

圖2 各組裸鼠移植瘤生長曲線Fig.2 Growth curve of transplanted tumor in each groupNote:A.Tumor growth curve；B.Transplanted tumor at 28th day.1.Control group；2.LV-CON group；3.LV-PRRX1group；4.LV-PRRX1+XAV939 group.Compared with LV-CON group,*.P P

2.3PRRX1過表達促進了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤組織壞死 采用HE染色觀察各組裸鼠移植瘤的病理學(xué)變化(圖3)。正常對照組與LV-CON組移植瘤組織中腫瘤細胞細胞核明顯、分布密集，且著色較深，細胞相對完整；LV-PRRX1組腫瘤細胞細胞核固縮，細胞間隙變大，分布彌散，有淋巴細胞浸潤現(xiàn)象；而LV-PRRX1聯(lián)合XAV939組細胞核固縮、淋巴細胞浸潤現(xiàn)象更加明顯，部分細胞壞死。提示PRRX1過表達促進了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤組織壞死，而且XAV939能進一步促進這一作用。

2.4PRRX1過表達促進了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤腫瘤細胞凋亡 采用TUNEL染色觀察各組裸鼠移植瘤腫瘤細胞凋亡狀況(圖4)。正常對照組與LV-CON組移植瘤組織中腫瘤細胞凋亡率無顯著差異；與LV-CON組比較，LV-PRRX1組腫瘤細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；而與LV-PRRX1組比較，LV-PRRX1聯(lián)合XAV939組腫瘤細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。提示PRRX1過表達促進了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤腫瘤細胞凋亡，而且XAV939能進一步促進這一作用。

圖3 HE染色觀察移植瘤病理變化(×200)Fig.3 Pathological changes of transplanted tumor were observed by HE staining(×200)Note:1.Control group；2.LV-CON group；3.LV-PRRX1group；4.LV-PRRX1+XAV939 group.

圖4 TUNEL染色檢測各組移植瘤腫瘤細胞凋亡(×200)Fig.4 Apoptosis of tumor cells of transplanted tumors in each group was detected by TUNEL staining(×200)Note:A.TUNEL staining；B.Percentage of apoptotic cells.1.control group；2.LV-CON group；3.LV-PRRX1group；4.LV-PRRX1+XAV939 group.Compard with LV-CON group,*.P P

圖5 免疫組化檢測各組移植瘤中Ki-67的表達(×200)Fig.5 Expression of Ki-67 in transplanted tumor tissue was detected by immunohistochemical staining(×200)Note:A.Immunohistochemical staining；B.Percentage of positive cells.1.Control group；2.LV-CON group；3.LV-PRRX1 group；4.LV-PRRX1+XAV939 group.Compared with LV-CON group,*.P P

圖6 Western blot檢測各指標(biāo)蛋白表達水平Fig.6 Protein expression levels of each indicator were tested by Western blotNote:1.Control group；2.LV-CON group；3.LV-PRRX1 group.4.LV-PRRX1+XAV939 group.Compared with LV-CON group,*.P P

2.5PRRX1過表達抑制了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤中Ki-67的表達 采用免疫組化觀察各組裸鼠移植瘤中Ki-67的表達(圖5)。正常對照組與LV-CON組Ki-67陽性細胞占比無顯著差異；與LV-CON組比較，LV-PRRX1組Ki-67陽性細胞占比顯著降低(P<0.05)；而與LV-PRRX1組比較，LV-PRRX1聯(lián)合XAV939組Ki-67陽性細胞占比顯著降低(P<0.05)。提示PRRX1過表達抑制了SMMC-7721細胞裸鼠移植瘤中Ki-67的表達，而且XAV939能進一步促進這一作用。

2.6Wnt/β-catenin信號通路參與PRRX1過表達對SMMC-7721細胞體內(nèi)致瘤性的調(diào)控 采用Western blot檢測各組移植瘤中PRRX1蛋白及Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc的表達(圖6)。與LV-CON組比較，LV-PRRX1組PRRX1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，β-catenin、c-Myc蛋白水平顯著降低(P<0.05)；而與LV-PRRX1組比較，LV-PRRX1聯(lián)合XAV939組PRRX1蛋白水平無顯著變化，而β-catenin、c-Myc蛋白水平顯著降低(P<0.05)。提示PRRX1過表達通過抑制Wnt/β-catenin信號通路進而發(fā)揮抗腫瘤作用。

3 討論

已有研究表明，低表達的PRRX1是HCC患者擁有較差5年生存期的獨立預(yù)后因素；下調(diào)PRRX1的表達能通過獲取腫瘤干細胞樣屬性促進HCC患者的不良預(yù)后[18]。Wnt/β-catenin是一種在進化過程中高度保守的信號通路，且已被證明在包括HCC在內(nèi)的多種多發(fā)性腫瘤中過度活躍[19,20]。本研究主要研究過表達PRRX1是否通過抑制Wnt/β-catenin信號通路降低肝癌細胞的體內(nèi)致瘤性。

不同于一般的EMT誘導(dǎo)劑，PRRX1作為一種新的EMT誘導(dǎo)劑已被證明參與腫瘤干細胞特性的獲取，且PRRX1的缺失促進了乳腺癌和HCC在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移[14,18]。而本研究顯示，過表達PRRX1顯著抑制了肝癌細胞裸鼠移植瘤的生長。但過表達PRRX1被證明與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。在對于HCC細胞的生物學(xué)屬性進行研究時發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PRRX1的表達顯著抑制了HCC細胞的凋亡，并促進了遷移和侵襲能力[17]。但在胃癌和肺癌的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，顯著上調(diào)PRRX1的表達才能增加癌細胞的EMT屬性，主要表現(xiàn)為細胞增殖、遷移和侵襲能力的增加[16,21]。這提示PRRX1作用在不同類型腫瘤中的存在異質(zhì)性。此外，PRRX1同樣參與腫瘤化學(xué)抗性的調(diào)控，例如在人肝癌細胞株(HuH7、Hep3B、HepG2和PLC/PRF/5)中，過表達PRRX1增加了對5-FU的藥物敏感性[18]。同樣在肝癌細胞株中，過表達PRRX1降低了放療、化療過程中的腫瘤干細胞陽性率[22]。結(jié)合本研究其他實驗結(jié)果，過表達PRRX1促進了移植瘤的組織壞死，增加了瘤體組織的腫瘤細胞凋亡，下調(diào)了瘤體組織Ki-67的表達；我們證實過表達PRRX1能顯著降低肝癌細胞的體內(nèi)致瘤能力。

異常激活Wnt/β-catenin信號通路在許多類型的人類腫瘤中普遍存在，且它被認(rèn)為能促進腫瘤的發(fā)展。抑制Wnt/β-catenin信號通路成為多種腫瘤靶向治療的有效途徑。例如，在食管鱗狀細胞癌中，婆羅雙樹樣基因4(SALL4)沉默被證明能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化來促進癌細胞EMT向MET轉(zhuǎn)化，進而抑制癌細胞體外的生存、遷移、侵襲及抗藥性，以及體內(nèi)成瘤能力[23]。以siRNA干擾β-catenin的表達能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路顯著增加食管癌順鉑化療的敏感性[24]。而在HCC中，Wnt/β-catenin信號通路被證明參與了miR-610介導(dǎo)的癌細胞生物學(xué)習(xí)性，下調(diào)miR-610的表達能激活Wnt/β-catenin信號通路促進癌細胞的增殖活性、周期進程及體內(nèi)致瘤能力[25]。在乳腺癌中，miR-1299過表達通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進癌細胞的增殖及成瘤能力[26]。在宮頸癌中，沉默孤核受體DAX1能顯著抑制癌細胞的體外增殖、癌癥干細胞屬性以及體內(nèi)成瘤能力，且這一效應(yīng)同樣被證明與抑制Wnt/β-catenin信號通路的活化有關(guān)[27]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，PRRX1過表達能顯著降低Wnt/β-catenin信號通路核心蛋白β-catenin以及其下游效應(yīng)因子c-Myc的表達水平；Wnt/β-catenin通路抑制劑XAV939對PRRX1過表達抑制移植瘤的生長具有協(xié)同作用，提示W(wǎng)nt/β-catenin通路參與了PRRX1介導(dǎo)的肝癌細胞體內(nèi)致瘤能力的調(diào)控。

綜上所述，PRRX1過表達能顯著抑制肝癌細胞體內(nèi)致瘤性，主要表現(xiàn)為促進瘤體組織壞死，促進腫瘤細胞凋亡，進而抑制移植瘤的惡性生長。這一機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)，聯(lián)合應(yīng)用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑和PRRX1過表達調(diào)控可能成為肝癌治療十分具有潛力的方案。