楊敏慧 劉愛群 向光紅 李金海

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，?？?570208)

周圍神經(jīng)主要是指嗅覺、視覺神經(jīng)以外的腦神經(jīng)和脊神經(jīng)、自主神經(jīng)及其神經(jīng)節(jié)[1]。而周圍神經(jīng)病變(peripheral neuropathy,PN)主要是指原發(fā)于周圍神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)或功能損害的疾病，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)、感覺和自主神經(jīng)癥狀的減弱或者消失[2,3]。丙烯酰胺是一類神經(jīng)毒性的有機(jī)試劑，常用于工業(yè)生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)研究過程中。持續(xù)性接觸丙烯酰胺會(huì)導(dǎo)致慢性中毒，臨床主要表現(xiàn)為周圍神經(jīng)病變[4,5]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，研究證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞可以發(fā)育為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等，間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫原性低的特點(diǎn)，容易分離培養(yǎng)和遺傳背景穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[6,7]。本研究分析了間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)丙烯酰胺中毒性大鼠周圍神經(jīng)的影響以及作用機(jī)理，旨在為丙烯酰胺類試劑引起的周圍神經(jīng)疾病的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 65只雌性SD大鼠，SPF級(jí)，4月齡，體質(zhì)量(200.0±10.5)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，所有大鼠自由攝食飲水，相對(duì)溫度(26±5)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)；丙烯酰胺(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：18099)；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶均購自Thermofisher公司(批號(hào)分別為17561、237B1和1834E)；鼠抗人FITC-CD45、FITC-CD90、PE-CD105、PE-CD34、PE-CD73、PE-HLA-DR單克隆抗體、FITC-IgG1和PE-IgG1同型對(duì)照單克隆抗體均購自美國(guó)R&D公司(批號(hào)分別為A1231、A172、1717、1721、1745、1862、1854和1834E)。VEGF小鼠單克隆抗體、NGF單克隆抗體和多克隆抗體和GDNF單克隆抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司(批號(hào)分別為C321、3E2W和3907)；HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購自杭州華安生物有限公司(批號(hào)：180203)；HE染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司(批號(hào)：1789)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(批號(hào)分別為170801、180021和180322)；二氧化碳孵箱購自美國(guó)Thermo公司。

1.2方法

1.2.1BMSC細(xì)胞的制備 5只SD大鼠斷頸處死后，取脛骨和股骨，在無菌條件下將肌肉組織和結(jié)締組織分離，暴露脛骨和股骨。然后將脛骨和股骨中的骨髓細(xì)胞采用PBS緩沖液吹出，用紅細(xì)胞裂解液除去紅細(xì)胞后將1 500 r/min離心棄上清，沉淀采用低糖的DMEM培養(yǎng)基(10%FBS+1%青鏈霉素)重懸后，接種于10 cm系細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在接種后d2更換培養(yǎng)基，洗去未貼壁的細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至新的10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)，每隔 3 d 更換新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合后進(jìn)行傳代，傳至第4代時(shí)，采用流式細(xì)胞術(shù)分析間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)情況。

1.2.2模型構(gòu)建分組和治療 60只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和BMSC組，每組大鼠20只。模型組和BMSC組大鼠前兩周經(jīng)灌胃給予每只大鼠20 mg/kg的丙烯酰胺，停止給藥1周后，再重復(fù)灌胃給藥一次。以大鼠出現(xiàn)后肢癱瘓視為造模成功。建模成功后，治療組大鼠經(jīng)尾靜脈注射BMSC 1×107個(gè)/只，對(duì)照組和模型組注射等體積的生理鹽水。所有大鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房，并正常飲食。

1.2.3步態(tài)分析和評(píng)定 治療后第0、1、2、3、4和5周分別采用步態(tài)評(píng)分[8]分析3組大鼠的步態(tài)。將每只大鼠置于樹脂盒中觀察5 min并進(jìn)行評(píng)分，1分：大鼠能夠站立且行走時(shí)步態(tài)正常，前后肢活動(dòng)正常；2分：大鼠站立姿勢(shì)輕微異常，行走時(shí)輕微搖擺、打轉(zhuǎn)，雙后肢輕度無力；3分：大鼠能夠維持站立，行走時(shí)腹部著地，后肢外撇且呈鴨步，雙后肢肌力減弱；4分：大鼠無力支撐身體，腹部著地，無法行走。

1.2.4電生理分析 治療后第5周，全麻大鼠，背位固定，于坐骨神經(jīng)旁1～2 mm處插入針狀刺激電極刺激坐骨神經(jīng)，于比目魚肌腹部刺入另一針狀電極記錄神經(jīng)肌肉動(dòng)作電位。采用2.5倍閾電壓連續(xù)方波刺激坐骨神經(jīng)近端。用生理記錄儀對(duì)神經(jīng)肌肉動(dòng)作電位進(jìn)行處理，測(cè)定動(dòng)作電位潛伏期，并計(jì)算神經(jīng)傳導(dǎo)速度，掃描速度為4 000 m/s。

1.2.5神經(jīng)病理檢測(cè) 治療后第5周，每組大鼠在接受電生理檢測(cè)后處死，取患側(cè)脛神經(jīng)，用4%多聚甲醛固定后，鋨酸染色，然后取脛神經(jīng)踝上端約0.3 cm 的神經(jīng)進(jìn)行石蠟包埋，切片。然后采用顯微鏡觀察神經(jīng)纖維變性程度。

1.2.6Western blot分析 治療后第5周，取大鼠外周組織50 mg，加入組織裂解液100 μl，碾磨勻漿，在冰上靜置裂解1 h，然后15 000 r/min離心15 min，取上清，應(yīng)用 BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。加入上樣緩沖液，金屬浴中煮沸30 min后，進(jìn)行SDS-PAGE(電壓：120 V，電流：300 mA，時(shí)間：90 min)，結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h后，采用VEGF(1∶1 000)、NGF(1∶1 000)和GDNF(1∶1 000)單克隆抗體在4℃孵育12 h，次日用PBST洗滌3次，每次5 min，采用HRP標(biāo)記的羊抗小鼠的二抗在室溫孵育2 h，用PBS洗滌3次，每次5 min，在PVDF膜上滴加ECL發(fā)光液，在化學(xué)發(fā)光儀上顯色蛋白條帶，X膠片進(jìn)行曝光顯影。用Image J圖像分析各組膠片掃描所得灰度值與內(nèi)參(Tubulin)的比值，即得VEGF、NGF和GDNF蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7氧化應(yīng)激指標(biāo)分析 治療后第5周，取大鼠外周血，離心得血清，分別采用羥胺法、可見分光光度法和比色法檢測(cè)所有大鼠治療后SOD、CAT和GSH-px的水平，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1BMSC的制備 在顯微鏡下觀察顯示，細(xì)胞在d4開始出現(xiàn)貼壁，d7出現(xiàn)集落分布，d10集落刺激可達(dá)到80%，細(xì)胞形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣(圖1A)。采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面標(biāo)記物顯示，細(xì)胞表達(dá)CD90和CD105,而不表達(dá)造血系標(biāo)志CD45和白細(xì)胞抗原HLA-DR(圖1B)。

2.23組大鼠治療后步態(tài)分析 與對(duì)照組大鼠比，模型組大鼠建模后1、2、3、4和5周步態(tài)顯著異常，評(píng)分顯著增加(P<0.05)。經(jīng)BMSC治療，BMSC組大鼠步態(tài)顯著改善，治療評(píng)分顯著下降(P<0.05)，見圖2。

2.33組大鼠治療后電生理分析 與對(duì)照組比，模型組大鼠神經(jīng)-肌肉潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。與模型組比，BMSC組大鼠神經(jīng)-肌肉潛伏期明顯縮短(P<0.05)。與對(duì)照組比，模型組大鼠神經(jīng)傳輸速度明顯減緩(P<0.05)。與模型組比，BMSC組大鼠神經(jīng)-肌肉潛伏期明顯增加(P<0.05)，見表1。

2.43組大鼠治療后神經(jīng)纖維變性比較 與對(duì)照組比，模型組大鼠神經(jīng)纖維變性程度(4.28±1.18)顯著增加(P<0.05)。與模型組比，BMSC組大鼠神經(jīng)纖維變性程度(2.35±0.68)顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖1 BMSC細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)記物分析Fig.1 Analysis of BMSC cell morphology and surf-ace markers

圖2 3組大鼠治療后步態(tài)分析Fig.2 Gait analysis of rats in 3 groups after treatmentNote: Compared with the control group,*.P

2.53組大鼠治療后神經(jīng)因子水平比較 與對(duì)照組比，模型組大鼠神經(jīng)組織中NGF和GDNF顯著降低(P<0.05)。與模型組比，BMSC組大鼠坐骨神經(jīng)組織NGF和GDNF顯著增加(P<0.05)。

2.63組大鼠治療后氧化應(yīng)激水平分析 與對(duì)照組比，模型組大鼠外周血SOD、CAT和GSH-px水平顯著降低(P<0.05)。與模型組比，BMSC組大鼠外周血SOD、CAT和GSH-px水平顯著升高(P<0.05)，見表2。

表1 3組大鼠神經(jīng)-肌肉潛伏期和傳輸速度比較(n=20)

Tab.1 Comparison of neuromuscular latency and transmission velocity in 3 groups (n=20)

GroupsLatency(ms)Transmission speed(μV)Control group0.92±0.1525.71±4.39Model group1.89±0.341)2)5.29±1.321)2)BMSC group1.21±0.2313.49±3.91F77.874174.518P0.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the BMSC group,2)P<0.05.

圖3 3組大鼠神經(jīng)組織神經(jīng)組織中NGF和GDNF表達(dá)Fig.3 Expression of NGF and GDNF in nerve tissue of 3 groupsNote: *.P

表2 3組大鼠治療后氧化應(yīng)激水平分析(n=20)

Tab.2 Analysis of oxidative stress levels in 3 groups after treatment (n=20)

GroupsSOD(U/ml)CAT(nmol/L)GSH-px[nmol/(min·g)]Control group54.81±1.639.44±1.78145.33±15.39Model group12.01±0.321)2)2.01±0.651)2) 34.91±8.171)2)BMSC group35.12±1.015.79±1.09102.76±19.32F7 285.834 173.291 274.921P0.000 0.000 0.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the BMSC group,2)P<0.05.

3 討論

隨著工業(yè)化程度的不斷推進(jìn)，因接觸一些有毒的化合物如丙烯酰胺、烷類和烯類等導(dǎo)致的外周神經(jīng)損傷病例越來越多。丙烯酰胺等有毒化合物可損傷外周神經(jīng)，神經(jīng)一旦損傷則很難恢復(fù)，表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)、感覺與自主神經(jīng)功能減弱或消失，嚴(yán)重者可造成肢體感覺喪失或截肢，影響患者的生活和工作。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種來源于中胚層的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞。目前研究證實(shí)，將間充質(zhì)干細(xì)胞移植到脊髓受損的大鼠，可見大量的細(xì)胞遷移至神經(jīng)病變部位，并表達(dá)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物蛋白，還可促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，從而緩解和改善脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能[9,10]。將間充質(zhì)干細(xì)胞注射紋狀體損傷的模型大鼠，間充質(zhì)干細(xì)胞可遷移至紋狀體部位并表達(dá)和分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的肽類生長(zhǎng)因子，廣泛調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的生存和分化，其家族成員如NGF和GDNF被證實(shí)可促進(jìn)神經(jīng)再生和側(cè)索生芽，增強(qiáng)神經(jīng)元的存活及生理功能，因此間充質(zhì)干細(xì)胞增強(qiáng)NGF和GDNF表達(dá)有助于改善受損的記憶功能[11]。上述實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞在治療神經(jīng)相關(guān)疾病中具有潛在的價(jià)值。本研究采用間充質(zhì)干細(xì)胞治療丙烯酰胺中毒所致的外周神經(jīng)疾病，旨在為有機(jī)試劑造成的外周神經(jīng)疾病治療提供解決方案。

本研究結(jié)果顯示，采用丙烯酰胺制備周圍神經(jīng)疾病大鼠，大鼠的步態(tài)、外周神經(jīng)系統(tǒng)以及神經(jīng)纖維病變顯著，提示周圍神經(jīng)病大鼠制備成功。給予周圍神經(jīng)病大鼠BMSC治療后，可顯著改善大鼠的步態(tài)，縮短神經(jīng)肌肉潛伏期和提高患病大鼠神經(jīng)傳導(dǎo)速度，提示BMSC對(duì)丙烯酰胺所致的周圍神經(jīng)病具有很好的治療效果。進(jìn)一步的研究顯示，周圍神經(jīng)病大鼠模型組周圍神經(jīng)組織的神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF和GDNF的水平顯著降低，機(jī)體的SOD、CAT和GSH-px水平顯著降低，提示周圍神經(jīng)病大鼠的神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性或功能降低，氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯，組織和機(jī)體超氧負(fù)離子累積，造成神經(jīng)元的凋亡和死亡。經(jīng)BMSC治療后，神經(jīng)生長(zhǎng)因子NGF和GDNF及機(jī)體的SOD、CAT和GSH-px水平均顯著增高，提示BMSC改善或緩解周圍神經(jīng)病癥狀可能與BMSC分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子，進(jìn)而恢復(fù)外周神經(jīng)功能，提高氧化酶活性，顯著減緩神經(jīng)元的死亡，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)組織的目的，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似[12,13]。但也有學(xué)者認(rèn)為BMSC受到細(xì)胞存活及趨化性等方面制約，治療周圍神經(jīng)病的效果并不顯著[14]，但該結(jié)果是否與BMSC劑量相關(guān)仍需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，BMSC可顯著提高丙烯酰胺誘導(dǎo)周圍神經(jīng)病大鼠模型的神經(jīng)組織營(yíng)養(yǎng)因子和抗氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而改善周圍神經(jīng)病變。