劉金泉 孫永勝 劉春云

(山西大同大學(xué)神經(jīng)病學(xué)與精神病學(xué)教研室，大同 037009 )

微小RNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度通常為22～30 nt的小分子RNA，通過降解靶基因或抑制靶基因翻譯調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，被證實(shí)在帕金森病(parkinson′s disease,PD)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等過程中發(fā)揮著重要作用[1-3]。1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)是一種可引起神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡的神經(jīng)毒，常被作為帕金森病細(xì)胞模型的誘導(dǎo)劑[4，5]。近年來，有研究顯示，在MPP+誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型中miR-34a表達(dá)上調(diào)，且miR-34a與PD神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)[6，7]，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚。沉默信息調(diào)控因子1(SIRT1)是一種組蛋白去乙?；?，具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性脫乙酰酶活性，被認(rèn)為在PD發(fā)病過程中具有神經(jīng)保護(hù)的作用[8]。本研究通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-34a與SIRT1 3′-非編碼區(qū)存在互補(bǔ)的核苷酸序列，猜測(cè)miR-34a可能通過靶向調(diào)控SIRT1表達(dá)影響PD神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，本研究以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y為研究對(duì)象，構(gòu)建MPP+誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型，擬探討miR-34a低表達(dá)能否通過靶向SIRT1抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。

1 材料與方法

1.1材料 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株SH-SY5Y購(gòu)于廣州中山大學(xué)細(xì)胞庫(kù)。兔抗人SIRT1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，MPP+、噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，青鏈霉素混合液購(gòu)于北京索萊寶公司，胎牛血清、胰蛋白酶和DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒和丙二醛(MDA)含量試劑盒購(gòu)于南京建成有限公司，脂質(zhì)體2000、Trizol試劑膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和RT-PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京鼎國(guó)昌盛公司。miR-34a模擬物(5′-UGGCAGUGUCUUAGGU-GGUUGU-3′)、miR-34a抑制劑(5′-UGGCAGUGUCUUAGGUGGUUGU-3′)及其相應(yīng)的陰性對(duì)照miR-NC(5′-UUCUCCGAACGUGU-CACGUTT-3′)和anti-miR-NC(5′-CAGUACUUUU-GUGUAGUACAA-3′)購(gòu)于百奧邁科生物公司。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所。SIRT1干擾序列siSIRT1及其陰性對(duì)照序列siNC是由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞以含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混液的DMEM/F12培養(yǎng)基于 5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。使用倒置顯微鏡定期觀察，2 d換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿瓶底80%時(shí)，以1∶3比例加入胰蛋白酶消化傳代。采用生長(zhǎng)狀況良好的第3代指數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MPP+作用濃度的篩選 將指數(shù)期的SH-SY5Y細(xì)胞以每孔200 μl(濃度為6×104個(gè)/ml)種植于96孔細(xì)胞板上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)12 h后，加入終濃度為500、1 000和2 000 μmol/L的MPP+，其中每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)平行孔。于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)液加入150 μl(濃度為0.5 mg/ml)的MTT溶液于培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)4 h。棄上清液后，加入二甲基亞砜150 μl振蕩反應(yīng)10 min使MTT結(jié)晶充分溶解。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm，以對(duì)照組的百分比表示各組細(xì)胞活力。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)miR-34a和SIRT1 mRNA的表達(dá) 將指數(shù)期的SH-SY5Y細(xì)胞按照每孔3×105個(gè)種植于6孔細(xì)胞板上，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h后加入500、1 000和2 000 μmol/L濃度的MPP+作用48 h。收集各組細(xì)胞后，參照Trizol試劑說明書步驟提取細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，根據(jù)上海生工生物合成的PCR引物(miR-34a F:5′-CCCACTCACCGTACTAA-3′，R:5′-GTGGTTTCAAGGCCAGATGT-3′；內(nèi)參U6 F:5′-CTCGCTTCGGC-AGCACA-3′，R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；SIRT1F:5′-TGAAAGTGATGAGGAGGATAGAGCC-3′，R:5′-CAACCTGTTCCAGCGTGTCTATGT-3′；內(nèi)參GAPDH F:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，R:5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′)將配制的25 μl反應(yīng)體系(包含2 μl cDNA、SYRY Premix Ex TaqⅡ12.5 μl、上下引物各1 μl和ddH2O 8.5 μl)上PCR儀按照95℃ 預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃ 延伸30 s，共循環(huán)38次的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增。2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞中miR-34a和SIRT1 mRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測(cè) 收集不同濃度MPP+作用48 h后的各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，以BCA法定量。取沸水浴變性后的總蛋白樣品60 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離。待分離結(jié)束后，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。經(jīng)含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉處理1 h后，加入SIRT1抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶1 000)4℃下孵育24 h。以封閉液洗膜3次后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗兔或抗鼠IgG的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。封閉液再次洗膜后，加入顯影液顯影，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5脂質(zhì)體介導(dǎo)miR-34a過表達(dá)或低表達(dá) 將指數(shù)期的SH-SY5Y細(xì)胞以每孔105個(gè)種植于6孔細(xì)胞板上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)，參照脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟將終濃度為20 nmol/L的miR-34a模擬物、miR-34a抑制劑及其相應(yīng)的對(duì)照miR-NC和anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至miR-34a組、anti-miR-34a組、miR-NC組和anti-miR-NC組中。待轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞分別采用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-34a、SIRT1 mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)SIRT1蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-34a與SIRT1的靶向關(guān)系 采用TargetscanHuman軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)SIRT1可能是miR-34a的潛在靶基因。為了驗(yàn)證miR-34a和SIRT1是否存在靶向關(guān)系，將SIRT1的3′UTR片段克隆到psiCHECK-2熒光素酶載體上，作為SIRT1野生型(SIRT1-WT)載體；利用TaKaRa點(diǎn)突變?cè)噭┖型蛔僑IRT1 3′UTR和miR-34a的結(jié)合位點(diǎn)，再克隆到psiCHECK-2熒光素酶載體上，作為SIRT1突變型(SIRT1-MUT)載體。將指數(shù)期的SH-SY5Y細(xì)胞以每孔104個(gè)細(xì)胞種植于96孔細(xì)胞板上，將其分為miR-34a/anti-miR-34a+SIRT1-WT組、miR-NC/anti-miR-NC+SIRT1-WT組、miR-34a/anti-miR34a +SIRT1-MUT組和miR-NC/anti-miR-NC+SIRT1-MUT組。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。參照脂質(zhì)體2000說明書先將miR-34a模擬物、miR-34a抑制劑及其陰性對(duì)照miR-NC和anti-miR-NC分別與SIRT1-WT、SIRT1-MUT共轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞中。待轉(zhuǎn)染48 h后，收集各組細(xì)胞并參照熒光素酶試劑盒說明書步驟檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7凋亡實(shí)驗(yàn)和氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)分組及處理 實(shí)驗(yàn)分為Control組：加入等量培養(yǎng)液；MPP+組：加入2 000 μmol/L MPP+；MPP++anti-miR-NC組：轉(zhuǎn)染miR-NC后給予2 000 μmol/L MPP+；MPP++anti-miR-34a組:轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑后給予2 000 μmol/L MPP+；MPP++anti-miR-34a+siNC組:共轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑和SIRT1干擾序列的陰性對(duì)照后，給予2 000 μmol/L MPP+；MPP++anti-miR-34a+siSIRT1組：共轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑和SIRT1干擾序列后，給予2 000 μmol/L MPP+。經(jīng)MPP+作用48 h后，收集各組細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中MDA含量和SOD、LDH活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集MPP+處理48 h后的各組SH-SY5Y細(xì)胞，以預(yù)冷的磷酸緩沖液漂洗后，加入Binding buffer 100 μl重懸細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC 5 μl和PI 10 μl于避光條件下染色15 min后，再次加入Binding buffer 400 μl，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中MDA含量和SOD、LDH活性 收集MPP+處理48 h后的各組SH-SY5Y細(xì)胞上清液，分別參照LDH試劑盒、SOD試劑盒和MDA試劑盒說明書步驟檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中LDH、SOD活性和MDA含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1不同濃度MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活及miR-34a和SIRT1表達(dá)的影響 不同濃度MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞后miR-34a表達(dá)升高而SIRT1表達(dá)降低，MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的損傷隨著MPP+作用濃度的增加而增大，表現(xiàn)出細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；同時(shí)，與對(duì)照組相比，不同濃度的MPP+可引起SH-SY5Y細(xì)胞中miR-34a表達(dá)升高，而SIRT1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平降低(P<0.05)，且呈濃度依賴性。故后續(xù)選用2 000 μmol/L作為MPP+最佳損傷濃度。見圖1、表1。

圖1 Western blot檢測(cè)SIRT1蛋白的表達(dá)Fig.1 Detection of SIRT1 protein expression by Western blot

表1 MPP+對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率、miR-34a表達(dá)和SIRT1表達(dá)的影響

Tab.1 Effects of MPP+on SH-SY5Y cell survival rate,expression of miR-34a and SIRT1

GroupsCell survival rate(%)miR-34aSIRT1 mRNASIRT1 proteinControl97.08±7.521.01±0.081.00±0.060.80±0.07500 μmol/L MPP+85.16±5.051)1.46±0.121)0.72±0.041)0.48±0.041)1 000 μmol/L MPP+68.43±3.121)2.02±0.251)0.52±0.031)0.31±0.031)2 000 μmol/L MPP+43.08±3.251)2.75±0.281)0.35±0.021)0.18±0.021)F64.21341.811144.169110.603P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;n=3.

2.2miR-34a靶向調(diào)控SIRT1的表達(dá) 圖2和表2結(jié)果顯示，與miR-NC組相比，在miR-34a過表達(dá)的miR-34a組中SIRT1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；而在miR-34a低表達(dá)的anti-miR-34a組中SIRT1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平較anti-miR-NC組顯著升高(P<0.05)。

2.3雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) TargetScan軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示miR-34a與SIRT1 3′ UTR 存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)。采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-34a過表達(dá)可降低SIRT1-WT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞的熒光素酶活性；而miR-34a低表達(dá)則升高SIRT1-WT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞的熒光素酶活性，與相應(yīng)對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但miR-34a表達(dá)對(duì)SIRT1-MUT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著影響。見表3、4。

圖2 Western blot檢測(cè)SIRT1蛋白的表達(dá)Fig.2 Detection of SIRT1 protein expression by Western blot

表2 miR-34a對(duì)SIRT1表達(dá)的影響

Tab.2 Effects of miR-34a on SIRT1 expression

GroupsmiR-34aSIRT1 mRNASIRT1 proteinmiR-NC1.00±0.08 0.59±0.040.79±0.06miR-34a3.85±0.131) 0.31±0.031)0.21±0.031)anti-miR-NC0.97±0.060.62±0.050.75±0.08anti-miR-34a0.24±0.022)1.22±0.072)1.18±0.092)F545.070177.818100.395P0.0000.0000.000

Note：Compared with the miR-NC group,1)P<0.05;compared with the anti-miR-NC group,2)P<0.05;n=3.

表3 SIRT13′ UTR與miR-34a的結(jié)合位點(diǎn)

Tab.3 Binding sites of SIRT1 3′UTR to miR-34a

GeneComplementary nucleotide sequencesBinding positionSIRT15′...AUCUUCACCACAAAUACUGCCAA...3′755-761 of SIRT1miR-34a3′...UGUUGGUCGAUUCUGUGACGGU...5′3′ UTR

2.4miR-34a低表達(dá)通過靶向SIRT1抑制MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡 圖3和表5結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，2 000 μmol/L MPP+處理后可引起miR-34a 表達(dá)和細(xì)胞凋亡率升高，而SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與MPP+組相比，轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑的MPP++anti-miR-34a組中miR-34a表達(dá)和細(xì)胞凋亡率顯著降低，而SIRT1 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑陰性對(duì)照的MPP++anti-miR-NC組與MPP+組間無顯著差異(P>0.05)。與MPP++anti-miR-34a+siNC組相比，轉(zhuǎn)染SIRT1干擾序列的MPP++anti-miR-34a+siSIRT1組細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白的表達(dá)顯著降低，而細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；另外，轉(zhuǎn)染無意義序列的MPP++anti-miR-34a+siNC組與MPP++anti-miR-34a+siNC組相比無顯著差異(P>0.05)。

表4 各組細(xì)胞的熒光素酶活性

Tab.4 Luciferase activity of cells in each group

GroupsLuciferase activitySIRT1-WTSIRT1-MUTmiR-NC1.03±0.081.01±0.07miR-34a0.37±0.041)1.03±0.09anti-miR-NC0.99±0.070.96±0.08anti-miR-34a2.46±0.182)0.98±0.07F207.4060.477P0.0000.707

Note：Compared with the miR-NC group,1)P<0.05;compared with the anti-miR-NC group,2)P<0.05;n=3.

圖3 miR-34a靶向SIRT1表達(dá)對(duì)MPP+ 誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of SIRT1 expression targeting by miR-34a on MPP+ induced SH-SY5Y cell apoptosisNote: A.Detection of SIRT1 protein expression by Western blot;B.Detection of apoptosis by flow cytometry.

表5 miR-34a靶向SIRT1表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

Tab.5 Effect of SIRT1 expression targeting by miR-34a on MPP+induced SH-SY5Y cell apoptosis

GroupsmiR-34aSIRT1 mRNASIRT1 proteinApoptotic rate(%)Control1.00±0.060.98±0.070.73±0.065.68±2.32MPP+2.68±0.211)0.33±0.031)0.17±0.031)24.54±3.661)MPP++anti-miR-NC2.70±0.231)0.34±0.031)0.12±0.021)22.86±3.151)MPP++anti-miR-34a1.39±0.131)2)0.58±0.041)2)0.43±0.031)2)13.45±1.121)2)MPP++anti-miR-34a+siNC1.36±0.111)2)0.56±0.041)2)0.47±0.041)2)12.96±1.051)2)MPP++anti-miR-34a+siSIRT11.41±0.121)2)0.32±0.021)3)0.15±0.021)3)19.78±1.321)2)3)F68.173113.691134.00827.960P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the MPP+group,2)P<0.05;compared with the MPP++anti-miR-34a group,3)P<0.05;n=3.

表6 各組中LDH活性、SOD活性和MDA含量的比較

Tab.6 Comparison of LDH activity,SOD activity and MDA content in each group

GroupsLDH(U/ml)MDA(nmol/ml)SOD(U/mg prot)Control225.76±12.250.39±0.0614.22±0.12MPP+379.48±13.661)1.02±0.091)7.54±0.131)MPP++anti-miR-NC365.55±12.701)0.97±0.081)7.15±0.121)MPP++anti-miR-34a284.12±8.851)2)0.52±0.041)2)12.28±0.251)2)MPP++anti-miR-34a+siNC288.09±10.051)2)0.50±0.031)2)12.32±0.221)2)MPP++anti-miR-34a+siSIRT1329.45±11.321)2)3)0.74±0.051)2)3)10.06±0.181)2)3)F73.80453.735770.338P0.0000.0000.000

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with the MPP+group,2)P<0.05;compared with the MPP++anti-miR-34a group,3)P<0.05;n=3.

2.5miR-34a低表達(dá)通過靶向SIRT1減輕MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷 表6結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，2 000 μmol/L MPP+處理SH-SY5Y細(xì)胞后，SH-SY5Y細(xì)胞上清液中MDA含量和LDH活性顯著升高，而SOD活性顯著降低(P<0.05)；與MPP+組相比，MPP++anti-miR-34a組中MDA含量和LDH活性顯著降低，而SOD活性顯著升高(P<0.05)；但是，MPP++anti-miR-NC組和MPP+組比較無顯著差異(P>0.05)。與MPP++anti-miR-34a組相比，MPP++anti-miR-34a+siSIRT1中MDA含量和LDH活性顯著升高，而SOD活性顯著降低(P<0.05)；然而，MPP++anti-miR-34a+siNC和MPP++anti-miR-34a組比較無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

本研究以500、1 000和2 000 μmol/L的MPP+作用于SH-SY5Y細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞存活率逐漸降低，同時(shí)miR-34a的表達(dá)逐漸升高，而SIRT1的表達(dá)逐漸降低。這提示miR-34a和SIRT1在MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮著重要作用。本研究以2 000 μmol/L的MPP+作用后發(fā)現(xiàn)，SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率顯著升高，且細(xì)胞上清液中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)抗氧化酶SOD活性降低，而脂質(zhì)過氧化物MDA含量、活細(xì)胞胞漿內(nèi)酶LDH活性升高。結(jié)果表明，MPP+可誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，帕金森病細(xì)胞模型構(gòu)建成功。LDH活性大小可較好地反映出細(xì)胞膜的損傷程度；MDA含量的高低可間接反映機(jī)體遭受自由基攻擊的程度；SOD活力的高低可間接反映機(jī)體清除自由基的能力大?。蝗叱１蛔鳛榉从臣?xì)胞氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)[9,10]。另外，本研究采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，SIRT 13′UTR存在與miR-34a互補(bǔ)的核苷酸序列，采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)SIRT1是miR-34a的靶基因，同時(shí)RT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-34a可負(fù)向調(diào)控SIRT1 mRNA和蛋白的表達(dá)。這表明miR-34a可靶向調(diào)控SIRT1的表達(dá)，該結(jié)果與陳薊等[11]得到的miR-34a與SIRT1存在靶向關(guān)系的結(jié)果相似。

PD是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，以黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的缺失為主要病理改變，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩、肌肉僵直、姿勢(shì)反射障礙等其常見的臨床表現(xiàn)；目前，關(guān)于PD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但越來越多的研究證實(shí)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷是PD發(fā)病的重要機(jī)制[12-14]。因此，尋找有效抑制PD神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷的分子靶點(diǎn)對(duì)PD治療具有重要意義。miR-34a是一種與細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切的miRNA。Zhong等[15]研究指出，miR-34a的下調(diào)可抑制氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。季青山等[16]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-34a表達(dá)可使氧化應(yīng)激條件下人晶狀體上皮細(xì)胞存活率升高，改善過氧化氫誘導(dǎo)氧化損傷。miR-34a是一種在腦組織中廣泛表達(dá)的miRNA，被證實(shí)與阿爾茨海默病、癲癇和PD病等神經(jīng)性疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[17-19]，且miR-34a低表達(dá)在神經(jīng)細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮著重要保護(hù)作用[20,21]。SIRT1是一種在調(diào)控細(xì)胞周期、能量代謝、抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等多種細(xì)胞功能中發(fā)揮著重要作用的去乙?；?，被證實(shí)其激活可通過抑制MAPK通路保護(hù)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[22]。

本研究通過轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑成功下調(diào)miR-34a的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷均明顯受到抑制；同時(shí)轉(zhuǎn)染SIRT1干擾序列成功下調(diào)SIRT1 表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，miR-34a低表達(dá)對(duì)MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的抑制作用明顯減弱。這表明miR-34a低表達(dá)可通過靶向SIRT1抑制MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。該結(jié)果與Wang等[23]發(fā)現(xiàn)的抑制miR-34a可通過靶向激活SIRT1減輕腸缺血/再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和凋亡的分子機(jī)制相似。

綜上所述，miR-34a表達(dá)抑制在MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激過程中具有保護(hù)作用，而miR-34a對(duì)SIRT1的靶向激活是該過程的重要機(jī)制。這可能是miR-34a低表達(dá)發(fā)揮PD神經(jīng)保護(hù)作用的新線索，也為miR-34a有望成為PD防治的候選靶基因提供新的參考依據(jù)。