吳 瑞，李秀敏，苗明三

(河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450046)

支氣管哮喘(稱為“哮喘”)，是一種以氣道炎癥細胞浸潤為病理特征和氣道高反應性為生理特征的慢性炎癥性疾病。近年來，由于環(huán)境因素和生活方式的改變，哮喘的發(fā)病率逐年上升[1-2]。因此，醫(yī)學界越來越關注與哮喘有關的研究。由于臨床人體試驗的局限與困難性,目前主要運用動物實驗來探索哮喘發(fā)病機制、評測新的治療方法、研究開發(fā)新的治療藥物。哮喘動物實驗研究的主要和中心環(huán)節(jié)是建立哮喘實驗動物模型，該模型必須高度貼合人類哮喘的病理生理學和臨床變化過程，但目前實驗研究所使用的哮喘動物模型存在造模方法復雜、模型吻合度低、模型成功率低等問題。因此本文對最近10年有關建立哮喘動物模型的相關實驗文獻進行了整理分析，從實驗動物種類、激發(fā)方式、致敏方法、檢測指標等方面總結哮喘動物模型的研究進展,提出建立與臨床哮喘狀態(tài)相一致的動物模型的完善建議，為哮喘的臨床及實驗研究提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

以“哮喘”和“動物模型”為主題，在中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫高級檢索界面進行搜索，時間范圍是2009年1月至2019年8月，共檢索到期刊文獻248篇。

1.2 納入標準

選擇研究哮喘的全部動物實驗文獻；會議、碩博論文等不作為納入的范疇；排除綜述類和資料不全的文獻。最終有118篇文獻符合納入標準，將收集的實驗動物種類、激發(fā)方式、致敏方法、檢測指標等錄入Excel 2013歸納處理，以此建立哮喘動物模型的數(shù)據(jù)庫。實驗動物名稱、種類等均參照《實驗動物和動物實驗技術》[3]進行規(guī)范，統(tǒng)一處理具有不同名稱的動物種類，如“荷蘭豬”統(tǒng)一為“豚鼠”。

1.3 統(tǒng)計學方法

首先對各項數(shù)據(jù)單獨歸納整理，分析其應用所占比例，其次對各項數(shù)據(jù)進行整體分析，對模型建立方法和檢測指標進行系統(tǒng)性和區(qū)域化整理。

2 結果

2.1 統(tǒng)計結果

2.1.1 實驗動物種類

將錄入的118篇實驗文獻[4-22]中的全部實驗動物種類進行分類排序，統(tǒng)計得出共有8類實驗動物，累積頻率118次。在這些實驗動物中，使用頻數(shù)≥10的共有4種，累積出現(xiàn)109次，使頻數(shù)最高的前四位分別是BALB/c小鼠(43次，36.4%)、SD大鼠(42次，35.5%)、Wistar大鼠(12次，10.2%)和豚鼠(12次，10.2%)。在118篇實驗文獻中，實驗動物種類分布情況詳情見表1。

2.1.2 造模激發(fā)方式

將118篇實驗文獻所涉及的造模激發(fā)方式進行分類規(guī)范。統(tǒng)計得出，118篇實驗文章涵蓋了5種激發(fā)方式。在5種激發(fā)方式中，使用最多激發(fā)方式為霧化激發(fā)(102次，86.4%)。造模激發(fā)方式分類及使用頻數(shù)見表2。

2.1.3 致敏方法

將118篇實驗文獻所涉及的致敏方法進行分類規(guī)范。統(tǒng)計得出，118篇實驗文章涵蓋了6種致敏方法。在6種致敏方法中，使用最多的致敏方式為卵清白蛋白致敏(107次，90.6%)。由于這些實驗文獻致敏時基本采用氫氧化鋁為佐劑，故其使用情況不再歸納統(tǒng)計。致敏方法分類及使用頻數(shù)見表3。

2.1.4 檢測指標

將錄入的118篇實驗文獻中的全部檢測指標進行分類排序。在這些檢測指標中，若同一組織被分成不同的檢測指標，則分別統(tǒng)計，如肺組織在同一實驗中既檢測肺組織病理又做肺組織免疫組化；若同一組織被同時檢測多個同類型指標，則歸為一類，不再分開統(tǒng)計，如血清中同時檢測IL-4、IL-17A、sIgE、sIgG1、sIgG2a等，則把這些指標統(tǒng)稱為血清指標，同一實驗只計入一次。統(tǒng)計結果表明，118篇實驗文獻涵蓋16種不同的指標類型，累積頻數(shù)355次。其中檢測較多的指標為肺組織病理(92次，77.9%)、血清中生化指標(49次，41.5%)、肺泡灌洗液細胞分類計數(shù)(42次，35.6%)、肺組織免疫組化(40次，33.9%)、肺泡灌洗液上清中生化指標(39次，33.1%)等。檢測指標分類及使用頻數(shù)見表4。

表1 實驗動物種類頻數(shù)分布

表2 造模激發(fā)方式分類及使用頻數(shù)統(tǒng)計

表3 致敏方法分類及使用頻數(shù)統(tǒng)計

表4 檢測指標分類及使用頻數(shù)

2.2 結果分析

建立哮喘動物模型,是利用所選種類的動物更加貼合地模仿哮喘疾病的病理生理過程與特征。目前還未發(fā)現(xiàn)與人類發(fā)病過程完全相同的動物自發(fā)性哮喘模型,因此需要人工加以復制,鼠類動物因其基因組序列與人類相似，常被研究者用來建立哮喘模型。通過表1可以看出，建立哮喘動物模型多使用BALB/c小鼠、SD大鼠、Wistar大鼠和豚鼠。據(jù)報道BALB/c小鼠對致敏原較易產(chǎn)生氣道炎癥反應及氣道高反應性，從而更加容易復刻哮喘模型，同時BALB/c小鼠也是受到國外廣泛認同的哮喘動物模型品系，用其進行哮喘動物實驗研究更容易受國際醫(yī)學界認可[23-25]。SD大鼠和Wistar大鼠的來源廣泛，容易飼養(yǎng)繁殖，價格相對便宜,生物學試劑種類多并且容易獲得,對抗原的反應性較為一致，在測量指標較多的情況下，研究者更傾向于選擇其作為實驗動物。在建立模型時，豚鼠更容易被致敏,因其反應的靶器官為肺,接觸致敏原后容易產(chǎn)生過敏變態(tài)反應,程度較大鼠、小鼠強,因此在研究中應用廣泛。但因為豚鼠繁殖率較低、飼養(yǎng)條件要求高、相關配合的免疫學試劑相對不足等原因，其使用頻次低于BALB/c小鼠和SD大鼠。此外，在統(tǒng)計分析過程中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)實驗文章選擇雌性動物作為實驗研究對象，筆者查閱資料后發(fā)現(xiàn)，霧化激發(fā)后雌鼠的氣道炎癥、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤程度、支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞數(shù)等哮喘特征均比雄鼠更為嚴重，就建立哮喘模型來說，雌鼠比雄鼠更有優(yōu)勢[26]。

建立哮喘動物模型最主要是使動物模型出現(xiàn)免疫原性及免疫應答,防止脫敏情況發(fā)生，因此在制備哮喘模型過程先采用抗原致敏，使動物機體內存在致敏物，然后氣道局部激發(fā)，誘導動物產(chǎn)生哮喘反應。從表2和表3可以看出，本文統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)使用最多的致敏抗原為OVA，在全部實驗文章的致敏方法中占比90.6%；使用最多的激發(fā)方式為霧化激發(fā)，在全部實驗文章的激發(fā)方式中占比86.4%。研究表明OVA為異種蛋白, 有較強的抗原性和免疫原性，能成功建立哮喘氣道慢性變應性炎癥模型[27]。致敏后，大多采用霧化激發(fā)的方式使模型動物口鼻完全暴露在造模激發(fā)液中，霧化器長時間持續(xù)激發(fā)刺激動物，激發(fā)液經(jīng)呼吸道進入動物機體后可直接作用于氣道、肺，從而成功誘導肺產(chǎn)生炎癥反應[28]。在激發(fā)后，實驗動物會出現(xiàn)較明顯的頭面部瘙癢、站立不穩(wěn)、腹式呼吸(呼吸短促)等類似哮喘發(fā)作的癥狀，這些現(xiàn)象可以作為評價模型成功的重要指標。

哮喘動物模型應該具備氣道炎性細胞浸潤、氣道高反應性、血清IgE水平增高等特征。而這些特征可以在肺組織病理、血清中生化指標、肺泡灌洗液細胞分類計數(shù)、肺組織免疫組化、肺泡灌洗液上清中生化指標等指標中體現(xiàn)。肺組織病理是評價哮喘模型是否成功的重要指標，哮喘經(jīng)常會由急性炎癥反復發(fā)作而轉變?yōu)槁匝装Y,因此氣道反復損傷與修復病理組織鏡下觀察可以看到大量炎性細胞、炎癥介質浸潤。經(jīng)過本文統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，118篇實驗文獻中所測得血清生化指標較多的為sIgE、IgE、TNF-α、IL-4、 IL-5、IL-10、IL-13、IL-17、干擾素-γ(IFN-γ)等，這些指標可以有效評價炎癥反應情況。肺泡灌洗液中各類炎癥細胞和上清中的生化指標在評價氣道炎癥中發(fā)揮重要作用，例如，中性粒細胞水平與哮喘嚴重程度呈正相關[29]。免疫組化技術是根據(jù)抗原抗體的結合反應與化學顯色原理, 使組織切片中待測細胞的化學成分通過過氧化物酶等標記出來, 便于顯微鏡的觀察與統(tǒng)計，對過敏性哮喘小鼠模型成功情況的判定具有重要意義[30]。

3 討論

哮喘的發(fā)病機制十分復雜,醫(yī)學界至今還不能將其解釋清楚，但目前能確定的是哮喘的發(fā)病機制跟氣道炎癥、氣道高反應性以及免疫耐受受損相關[28]。因此在建立哮喘動物模型時要從這些方面入手。

哮喘動物模型的建立方法多種多樣，但目前所建立的哮喘動物模型還不能完全等同人類哮喘疾病的病理生理過程，所以在建立貼近臨床、結合哮喘表型、結合哮喘疾病發(fā)生發(fā)展過程及病理生理改變的哮喘動物模型是未來的主要研究方向。通過對近10年哮喘實驗文獻中的數(shù)據(jù)進行挖掘整理可知，使用BALB/c小鼠或SD大鼠作為實驗動物，采用霧化激發(fā)的方式霧化致敏，用OVA作為致敏抗原，可以有效提高模型的成功率，指標選取建議選取肺組織病理、血清中生化指標、肺泡灌洗液細胞分類計數(shù)等作為評價指標，此外在建立模型時還要綜合考慮到方法、給藥劑量、實驗目的及實驗條件等。作者期望通過自己的整理能為提高造哮喘動物模型成功率及評價受試藥物有效性提供一定的方法學參考。