郭玉倩，陸姜利，角建林，曾躍勤，梁 張*，鄭 紅*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，昆明 650500； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)技術(shù)轉(zhuǎn)移中心，昆明 650031； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)分子臨床研究，昆明 650500)

越來越多的研究表明腸道菌群失調(diào)與腸道炎癥的有密切聯(lián)系。腸道菌群的多樣性及豐度處于平衡狀態(tài)時，能維持宿主正常的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化、能量代謝、免疫功能、神經(jīng)生理功能等[1-2]。腸道微生物能激活樹突狀細胞表面的Toll樣受體(TLRs)，導(dǎo)致IL-10、IL-12的分泌，進而誘導(dǎo)Th0分化為Th1、Th2。但腸道微生物引起腸道炎癥的具體機制尚需進一步闡明[3-4]。

D-半乳糖在機體內(nèi)聚集，會導(dǎo)致活性氧類(ROS)的蓄積與激活，誘導(dǎo)IL-1β、IL-6等多種細胞因子的表達，引起結(jié)腸炎性細胞浸潤。但是D-半乳糖介導(dǎo)的腸道炎癥反應(yīng)是否與腸道菌群有關(guān)，未見報道。白細胞介素-18(IL-18)是一種強力致炎性細胞因子，參與腸道免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)。有報道稱，IL-18的分泌與腸道菌群關(guān)系密切[5]。因此，本實驗通過分析D-半乳糖作用下，新型實驗動物樹鼩回腸、盲腸、結(jié)腸組織IL-18的表達和內(nèi)容物菌群的變化情況，初步探索腸道炎癥反應(yīng)與菌群微生態(tài)失調(diào)的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級中國樹鼩滇西亞種10只，雄性，130～150 g，10月齡，購于昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部[SCXK (滇) K2015-0005]，飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)普通級實驗室[SYXK (滇) K2015-0002]。飼料配方參照本課題組前期研究[6]。實驗程序符合昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會要求(倫理審批號：KMMU2018022)，按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

D-半乳糖(Sigma-G5388，美國)；基因提取試劑盒(Omega，瑞士)；測序試劑盒(Hiseq Rapid SBS Kit v2，ThermoFisher，美國)；熒光計(Qubit 2.0，ThermoFisher，美國)；PCR 儀(Applied Biosystems? Gene Amp? PCR System 9700，美國)；免疫組化檢測抗體IL-18(ab243091，abcam公司，英國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物給藥及處理

樹鼩分為正常組和D半乳糖組(n=5)。每天下午2∶00，D-半乳糖組腹腔注射給藥，給藥量0.6 g/kg；正常組給予等量生理鹽水。8周后，禁食12 h，心臟采血處死樹鼩。距胃部約60～70 cm處，分離小腸的回腸(ileum，i)、大腸的盲腸(cecum，ca)和結(jié)腸(colon，co)，用生理鹽水沖洗、收集腸內(nèi)容物，儲存于-80℃冰箱；腸組織浸泡于多聚甲醛中，4℃保存。

1.3.2 免疫組化分析

回腸、盲腸和結(jié)腸組織在多聚甲醛中固定48 h后，石蠟包埋。按照切片、烘烤、脫蠟、抗原修復(fù)、一抗孵育過夜、二抗孵育和DAB顯色的流程操作，觀察IL-18在兩組樹鼩不同腸段的表達情況。

1.3.3 PCR擴增、文庫構(gòu)建、測序及生物信息學(xué)分析

使用DNA試劑盒抽提DNA，合成帶有Barcode的特異引物515F(5’-GTGYCAGCMGCC GCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，其中兼并堿基Y=C或T；M=A或C；H=A,C或T；V=A, C或G；W=A或T。對樣本的16S rDNA V4區(qū)域進行擴增。文庫構(gòu)建、測序、生物信息學(xué)參考文獻的方法進行[6]。統(tǒng)計分析在門、科水平上的物種組成及豐度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 D-半乳糖作用下樹鼩腸道3個部位IL-18表達增多

比較正常組(CT)和D-半乳糖組(D)樹鼩回腸、盲腸和結(jié)腸中IL-18的表達，免疫組化染色(圖1)顯示，IL-18在D-半乳糖組腸黏膜細胞質(zhì)呈棕黃色集中性表達，而在正常組基本無陽性表達。D-半乳糖組陽性細胞數(shù)和平均光密度值均顯著性高于正常組(P<0.05)，提示D-半乳糖能夠上調(diào)樹鼩腸道3個部位IL-18的表達。

2.2 腸道菌群構(gòu)成變化

正常樹鼩腸道菌群中共發(fā)現(xiàn)24個門，以厚壁菌門(55.9%)、變形菌門(20.6%)、放線菌門(10.2%)和擬桿菌門(7.9%)為主(圖2A)。D-半乳糖作用后，樹鼩3個腸段共發(fā)現(xiàn)22個門，并且優(yōu)勢菌發(fā)生變化。變形菌門(42.9%)、厚壁菌門(36.8%)、擬桿菌門(11.8%)和放線菌門(5.6%)為優(yōu)勢菌群(圖2B)。D-半乳糖組盲腸中變形菌門豐度升高(32.1±7.6)%與(13.0±6.6)%，P=0.03；結(jié)腸中放線菌門豐度減小(2.9±0.16)%與(10.7±3.7)%，P=0.02；回腸中疣微菌門豐度降低(0.1±0.02)%與(0.8±0.2)%，P=0.005。

使用熱圖分析科水平群落組成，選取豐度排名前50的科，縱坐標按照平均豐度由高到低進行排列(圖3)。正常組(圖3A)豐度最高的科依次是乳桿菌科(31.3%)、腸桿菌科(8.8%)、韋榮氏菌科(8.6%)和雙歧桿菌科(8.1%)；而D-半乳糖組(圖3B)腸桿菌科(27.8%)豐度最高，乳桿菌科(23.5%)、普雷沃氏菌科(8.3%)和伯克氏菌科(8.1%)豐度次之。在科層面，D-半乳糖組腸桿菌科和氣單胞菌科豐度顯著性升高，梭菌科、A4b科、雙歧桿菌科和鏈孢囊菌科豐度顯著性下降(表1)。

注：A：免疫組化顯示IL-18的表達。B：陽性細胞數(shù)和平均光密度值統(tǒng)計分析，兩組相比，**P<0.05。圖1 IL-18在兩組樹鼩回腸、盲腸和結(jié)腸中的表達Note. A， Immunohistochemistry of IL-18 expression. B， The positive cell area and average optical density values were analyzed statistically.**P<0.05, compared between the two groups.Figure 1 Expression of IL-18 in the ileum, cecum, and colon of tree shrews in the two groups

注：A：正常組；B：D-半乳糖組。圖2 門層面上Barplot聚類(各組均值)Note. A， Control group. B， D-galactose group.Figure 2 Clustering at the phylum level (mean of each group)

2.3 腸道菌群多樣性分析

比較正常組和D-半乳糖組樹鼩腸道菌群的Alpha多樣性，計算Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)；分析Beta多樣性的PCoA指數(shù)，發(fā)現(xiàn)兩組樹鼩3個腸段菌群的豐度(Chao1指數(shù))和多樣性(Shannon指數(shù))和PCoA指數(shù)均沒有顯著性差異(P>0.05)(表2)。

注：A：正常組；B：D-半乳糖組。圖3 科水平相對豐度熱圖(各組平均值)Note. A， Control group. B, D-Galactose group.Figure 3 Heatmap of relative abundance at the family level (mean of each group)

Table1Families with statistical differences in the same parts of the two groups

部位Parts菌群Flora組別Groups正常組Normal groupD- 半乳糖組D-galactose groupP值P value回腸Ileum 梭菌科Clostridiaceae 10.46%±0.18%0.10%±0.06%0.030盲腸Cecum 腸桿菌科EnterobacteriaceaeA4b科5.00%±1.80%5.20%±0.20%25.20%±6.80%3.50%±0.70%0.0080.015結(jié)腸Colon腸桿菌科Enterobacteriaceae雙歧桿菌科Bifidobacteriaceae氣單胞菌科Aeromonadaceae鏈孢囊菌科Streptosporangiaceae14.10%±5.40%8.90%±3.30%0.34%±0.08% 0.26%±0.0001%29.20%±7.60%1.90%±2.80%0.90%±0.30%0.13%±0.03%0.0490.0220.0240.001

表2 不同部位兩組Alpha多樣性和Beta多樣性指數(shù)比較

3 討論

眾多證據(jù)表明，腸道微生物群失調(diào)導(dǎo)致機體功能異常和疾病發(fā)生，例如潰瘍性腸炎[7]、腹瀉型腸易激綜合征[8]、慢性腎病[9]以及腸癌[10]等。D-半乳糖能引起結(jié)腸炎性細胞浸潤，但是引起腸道炎癥是否與腸道微生物群有關(guān)還未見報道。本研究選取菌群豐富的回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物，對樹鼩腸道菌群16S rDNA V4區(qū)域進行高通量測序，構(gòu)建正常樹鼩與D-半乳糖作用下樹鼩腸道3個部位微生物的基因圖譜，并進行了生物信息學(xué)分析。探索D-半乳糖作用下樹鼩腸道菌群與炎癥因子IL-18的關(guān)系。

IL-18在腸中主要由活化的巨噬細胞和上皮細胞產(chǎn)生，屬于Th1型致炎性細胞因子，能促進IL-1和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)產(chǎn)生，誘導(dǎo)Thl細胞產(chǎn)生干擾素-γ，促進TNF-α和多種趨化因子，在機體免疫損傷過程中發(fā)揮重要作用[11]。IL-18在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸粘膜[12]表達升高。結(jié)腸炎性期間IL-18升高引發(fā)杯狀細胞功能出現(xiàn)異常，進而引起粘液層的形成缺失，造成粘膜屏障破損，引發(fā)炎癥[13]。本實驗顯示，D-半乳糖作用下樹鼩回腸、盲腸和結(jié)腸粘膜IL-18的表達均明顯升高，提示D-半乳糖引起樹鼩腸道的炎癥反應(yīng)。

腸道菌群中厚壁菌門可將葡聚糖、肽聚糖[14]、糖原[15]等腸道內(nèi)宿主無法消化的多糖類物質(zhì)分解為可消化的小分子糖類, 促進宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。有報道指出，短鏈脂肪酸是腸道菌群的主要代謝產(chǎn)物，大鼠腸道菌群失調(diào)，引起短鏈脂肪酸代謝障礙，進而影響短鏈脂肪酸受體(GPR43)的表達，從而導(dǎo)致血清中IL-18的表達升高[16]，與本研究結(jié)果相同。所以我們推測，本實驗D-半乳糖導(dǎo)致樹鼩腸道菌群紊亂，進而引發(fā)IL-18表達升高。

腸道中變形菌門豐度升高，其代謝產(chǎn)物脂多糖的產(chǎn)生增多，進而引起慢性代謝性內(nèi)毒素血癥，可導(dǎo)致肥胖、糖尿病和胰島素抵抗發(fā)病率升高[17]。因此，變形菌門豐度升高，被認為是潛在的疾病診斷標志物以及腸道菌群紊亂的生物學(xué)標志物[18]。腸桿菌科(Enterobacteriaceae)可造成復(fù)雜腹腔內(nèi)感染、急性腸胃炎、敗血癥等[19]。氣單胞菌科(Aeromonadaceae)能夠引起人和動物腸炎[20]，引發(fā)草魚腸道炎性細胞浸潤和腸絨毛融合腫脹[21]。雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)是腸道有益菌，能抑制病原菌繁殖，減少毒性代謝物產(chǎn)生。本實驗發(fā)現(xiàn)，D-半乳糖作用下腸道菌群的結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，變形菌門(42.90%)上升為第1優(yōu)勢門。同時，樹鼩盲腸和結(jié)腸的腸桿菌科豐度顯著性升高，結(jié)腸中氣單胞菌科顯著性增加，雙歧桿菌科豐度明顯下降。提示D-半乳糖作用下，樹鼩腸道通過增加致炎性細菌及其毒性代謝產(chǎn)物，刺激腸黏膜炎癥因子IL-18的表達，繼而誘發(fā)腸道炎癥反應(yīng)。

綜上所述，在樹鼩小腸區(qū)域回腸段、大腸的盲腸、結(jié)腸組織中，D-半乳糖增加了炎癥因子IL-18表達和腸道菌群紊亂。由此推測，樹鼩腸道菌群失調(diào)促進腸道炎癥反應(yīng)，本研究為樹鼩作為腸道菌群動物模型提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。