邢 進(jìn)，劉 娜，馮育芳，張雪青，崔生輝，賀爭(zhēng)鳴，趙德明，岳秉飛*

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 102629； 2.中國(guó)食品藥品檢定研究院 食品化妝品檢定所，北京 100050； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

根據(jù)我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，病原菌的檢測(cè)一直依賴于分離培養(yǎng)和血清學(xué)鑒定，不僅需要檢測(cè)人員具有較豐富的經(jīng)驗(yàn)，效率和準(zhǔn)確性方面都亟待改進(jìn)。因此分子生物學(xué)方法，比如PCR、熒光定量PCR等已逐漸應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌檢測(cè)當(dāng)中。然而進(jìn)行病原菌的PCR檢測(cè)，但是需要對(duì)實(shí)驗(yàn)室實(shí)行嚴(yán)格的分區(qū)和污染控制?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)依靠激發(fā)微生物生成的蛋白質(zhì)譜與專有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，以實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的鑒定。其具有操作簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確等諸多優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為微生物鑒定的一種快速而可靠的工具[1]。目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用MALDI-TOF MS方法鑒定微生物效果的研究已廣泛開(kāi)展，其中與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)的病原菌主要有金黃色葡萄球菌[2-3]、肺炎鏈球菌[4]、乙型溶血性鏈球菌[5]、綠膿桿菌[6]、志賀菌[7]、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌[8]、棒狀桿菌[9-10]、巴斯德桿菌[11-12]、皮膚真菌[13]等。然而尚缺乏針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌整體鑒定效果的研究，本研究采用德國(guó)布魯克公司的Biotyper微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)相關(guān)菌株進(jìn)行鑒定，初步評(píng)價(jià)MALDI-TOF MS方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌的檢測(cè)效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株

40株標(biāo)準(zhǔn)菌株，購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保藏中心(ATCC)、中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心(CMCC)和中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)。見(jiàn)表1。

1.1.2 分離菌株

384株實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分離菌株包括沙門(mén)氏菌4株、金黃色葡萄球菌21株、綠膿桿菌32株、嗜肺巴斯德桿菌315株、多殺巴斯德桿菌2、肺炎鏈球菌1株、肺炎克雷伯桿菌3株、產(chǎn)酸克雷伯桿菌1株、志賀菌1株、牛棒狀桿菌2株、辛氏鮑特桿菌1株和嗜水氣單胞菌1株。其中金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、牛棒狀桿菌、綠膿桿菌和辛氏鮑特桿菌各有1株國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)理事會(huì)(ICLAS)國(guó)際比對(duì)菌株。

1.2 主要試劑與儀器

哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(Oxiod，CM0331)，脫纖維羊血(北京路橋)，厭氧袋和厭氧盒(三菱MGC AnaeroPack)，Nuclease-Free Water(Promaga，P1193)，PCR反應(yīng)試劑(TAKARA，R010 A)，細(xì)菌生化鑒定板(BD phoenix，448505，448008)，甲酸(J&K，299272)，基質(zhì)溶液(Bruker IVD HCCA，8255344)。16Sr DNA擴(kuò)增引物FD1∶5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，RP2∶5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’[14](上海生工)。布魯克微生物快速鑒定系統(tǒng)(Bruker MALDI Biotyper IVD)、A2級(jí)生物安全柜(NUAIR-NU-437-400S)、核酸提取儀(Qiagen QIAcubeHT)、超微量紫外分光光度計(jì)(Implen NanoPhotometer)、恒溫培養(yǎng)箱(Thermo IGS180)、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(BD phoenix100)、PCR儀(ABI Veriti96)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)

所有受試菌株接種于5%哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、志賀菌、克雷伯桿菌和嚙齒類檸檬酸桿菌置36℃培養(yǎng)24 h；巴斯德桿菌、鏈球菌、棒狀桿菌、支氣管鮑特桿菌和念珠狀鏈桿菌置36℃培養(yǎng)48 h；耶爾森菌和嗜水氣單胞菌至27℃分別培養(yǎng)48 h和24 h；空腸彎曲菌36℃厭氧培養(yǎng)48 h。初代培養(yǎng)物按相同條件傳代一次，次代菌落用于生化、測(cè)序和MALDI-TOF MS鑒定。

1.3.2 菌株的驗(yàn)證

對(duì)所有受試的標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離菌株使用BD phoenix 100進(jìn)行生化鑒定，同時(shí)提取基因組DNA，用引物FD1/RP2擴(kuò)增16S rDNA，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后經(jīng)Genbank BLAST比對(duì)，驗(yàn)證所用菌株的準(zhǔn)確性。

1.3.3 MALDI-TOF MS鑒定

根據(jù)布魯克微生物快速鑒定系統(tǒng)操作規(guī)程，采用直接轉(zhuǎn)移法制備待檢樣本。用一次性接種環(huán)挑取受試菌株單個(gè)菌落，直接涂抹于不銹鋼MALDI MSP靶板圓孔中，每孔滴加70%甲酸溶液1 μL，室溫下晾干。隨后用2 μL基質(zhì)溶液覆蓋，自然晾干后上機(jī)鑒定。結(jié)果用Biotyper 3.0 database處理分析。

2 結(jié)果

2.1 受試菌株驗(yàn)證

40株標(biāo)準(zhǔn)菌株和384株分離菌株經(jīng)生化和16S rDNA序列比對(duì)驗(yàn)證，所有菌株確定無(wú)誤。

2.2 MALDI-TOF MS分析

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株鑒定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)菌株的質(zhì)譜結(jié)果分值區(qū)間為1.532～2.546，鑒定正確率為90.0%(36/40)。對(duì)所有沙門(mén)氏菌只能鑒定到屬水平，不能確定到種。其中鼠傷寒沙門(mén)氏菌CMCC50115被鑒定為嚙齒類枸櫞酸桿菌；假結(jié)核耶爾森氏菌CMCC53521被鑒定為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌；志賀菌所有菌株全部有誤，結(jié)果為埃希氏菌或Kosakonia；嗜肺巴斯德桿菌Heyl型被鑒定為艱難梭菌；支氣管鮑特桿菌被鑒定為百日咳鮑特桿菌。

2.2.2 分離株鑒定結(jié)果

MALDI-TOF MS對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌分離株鑒定的準(zhǔn)確率為80.0%(307/384)。沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、多殺巴斯德桿菌、肺炎鏈球菌等幾種常規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌鑒定結(jié)果全部準(zhǔn)確；不在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的牛棒狀桿菌、辛氏鮑特桿菌和產(chǎn)酸克雷伯桿菌項(xiàng)目也都準(zhǔn)確鑒定。1株實(shí)驗(yàn)用魚(yú)需檢測(cè)的嗜水氣單胞菌鑒定準(zhǔn)確(結(jié)果見(jiàn)表2)。

3株肺炎克雷伯桿菌分離株1株鑒定正確，1株鑒定為產(chǎn)酸克雷伯桿菌，另1株鑒定為新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)；志賀菌分離株為福氏志賀菌，與標(biāo)準(zhǔn)菌株類似，被鑒定為大腸桿菌。315株嗜肺巴斯德桿菌分離株的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確率為76.5%(241/315)，具體鑒定結(jié)果見(jiàn)表3。利用這些分離菌株，重新構(gòu)建了嗜肺巴斯德桿菌質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，提高了鑒定的準(zhǔn)確率。

表1 標(biāo)準(zhǔn)菌種質(zhì)譜結(jié)果

注：a：2.300～3.000極可能的菌種鑒定；2.000～2.299可靠的菌屬鑒定，可能的菌種鑒定；1.700～1.999可能的菌屬鑒定；0.000～1.699不可靠的鑒定。

Note. a, Identification of 2.300～3.000 highly probable species. 2.000～2.299 secure genus and probable species. 1.700～1.999 probable genus. 0.000～1.699 unreliable identification.

表2 分離株鑒定結(jié)果匯總

表3 嗜肺巴斯德桿菌鑒定結(jié)果

注：a： ATCC12555；b： ATCC 35149；c： 北京流行株。圖1 嗜肺巴斯德桿菌ATCC12555、ATCC35149和北京流行株質(zhì)譜峰圖Note. a， ATCC12555. b， ATCC 35149. c， Beijing epidemic strains.Figure 1 MALDI-TOF MS spectrum of Pasteurella pneumophila ATCC12555,ATCC35149 and Beijing epidemic strains

3 討論

本次研究所用菌株包括了大部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見(jiàn)的可培養(yǎng)病原菌，還特別列入了幾株國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)理事會(huì)(ICLAS)檢測(cè)目錄中的細(xì)菌，用以評(píng)價(jià)質(zhì)譜方法檢測(cè)這些病原菌的效果。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物宿主涉及常規(guī)嚙齒類、兔、雞、魚(yú)、犬、猴、豬等。

微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)結(jié)果的可靠性依賴于相關(guān)菌株的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)[15]。本次研究中，鼠傷寒沙門(mén)氏菌、志賀菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、肺炎克雷伯桿菌、支氣管鮑特桿菌和嗜肺巴斯德桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株鑒定出現(xiàn)錯(cuò)誤。特別是對(duì)志賀菌的鑒定全部有誤，錯(cuò)誤結(jié)果主要為與大腸桿菌的混淆，與報(bào)道一致[7]，需要補(bǔ)充數(shù)據(jù)庫(kù)才能加以區(qū)分。

本研究中使用了315株嗜肺巴斯德桿菌分離株，主要分離自北京地區(qū)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。嗜肺巴斯德桿菌在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中感染率高，尚缺乏針對(duì)性的質(zhì)譜鑒定研究。本結(jié)果顯示，Bruker Biotyper系統(tǒng)及其原有數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)嗜肺巴斯德桿菌鑒定準(zhǔn)確率尚可，大部分菌株可鑒定到種，錯(cuò)誤結(jié)果可鑒定到科水平。最新分類研究已將嗜肺巴斯德桿菌的Jawetz和Heyl生物型重新分類并命名為Rodentibacterpneumotropicus和Rodentibacterheylii[16]兩種菌。通過(guò)分析二者質(zhì)譜峰圖(見(jiàn)圖1)，可見(jiàn)Heyl型與Jawetz型存在明顯差異，前者在3900 m/z和7800 m/z兩處的峰明顯高于后者。北京地區(qū)流行株應(yīng)屬于Heyl型，其質(zhì)譜峰圖與Heyl型更為相近，與生化結(jié)果、PCR方法，以及分子分型[17]的鑒定結(jié)果相符。通過(guò)重新自定義數(shù)據(jù)庫(kù)，即可快速區(qū)分嗜肺巴斯德桿菌Jawetz和Heyl生物型，即區(qū)分R.pneumotropicus和R.heylii，為二者的鑒別檢測(cè)提供依據(jù)。鑒于伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)暫未改版，各種自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對(duì)嗜肺巴斯德桿菌的分類也未做修改，檢測(cè)結(jié)果仍定義為嗜肺巴斯德桿菌。

質(zhì)譜檢測(cè)方法與自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)、PCR方法相比具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，不同品牌的質(zhì)譜系統(tǒng)數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)方法各不相同，但都需要依靠龐大的專有數(shù)據(jù)庫(kù)才能確保鑒定的準(zhǔn)確性。因此對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌的鑒定，還需在檢測(cè)中不斷收集更多的菌株補(bǔ)充和完善數(shù)據(jù)庫(kù)。目前國(guó)產(chǎn)微生物鑒定質(zhì)譜儀與進(jìn)口品牌鑒定效果已無(wú)明顯差距[15]，相信隨著本土菌株數(shù)據(jù)庫(kù)不斷豐富和完善，質(zhì)譜檢測(cè)將會(huì)逐步普及，并成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌檢測(cè)的重要手段。