郭 平，許敏華，張晶晶，金小寶，李小波，馬 艷

(廣東藥科大學(xué) 生物活性藥物研究重點實驗室，廣州 510006)

原發(fā)性肝癌是目前常見的惡性腫瘤之一[1-2]。建立自發(fā)轉(zhuǎn)移且便于觀察的人肝癌裸鼠模型是研究人肝癌的發(fā)展規(guī)律的基礎(chǔ)。復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所建立的高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系MHCC97H、HCCLM3以及高轉(zhuǎn)移人肝細(xì)胞癌裸鼠模型等為肝癌治療及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)研究提供了有效的手段，但這些模型不能連續(xù)、直觀地觀察原位腫瘤及肺和腹腔轉(zhuǎn)移灶，定量也不夠準(zhǔn)確[3-4]。Yang等建立一種可用熒光蛋白監(jiān)視的人肝細(xì)胞癌裸鼠模型，可通過活體熒光成像，無創(chuàng)診斷和監(jiān)測小鼠體內(nèi)腫瘤，但生物體內(nèi)有些物質(zhì)在受到激發(fā)光后也產(chǎn)生熒光，造成假陽性[5-6]。后有學(xué)者構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因Luc人肝癌細(xì)胞株建立裸鼠原位模型，可以體外實時監(jiān)測活體動物體內(nèi)肝臟腫瘤的生長情況，并能靈敏可靠地用于抗腫瘤治療效果的評價，但未探討腫瘤轉(zhuǎn)移情況[7-11]。

本研究采用肝內(nèi)細(xì)胞懸液移植法和腫瘤組織塊移植法建立Luc-GFP標(biāo)記的高轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞裸鼠原位肝癌模型，通過非侵襲性的生物發(fā)光成像技術(shù)和激發(fā)熒光成像技術(shù)，在活體水平觀察兩種方法建立的裸鼠原位肝癌模型腫瘤生長和轉(zhuǎn)移情況，可監(jiān)控腫瘤的生長、評價治療效果以及腫瘤的轉(zhuǎn)移。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級 BALB/c裸小鼠24只，6～8周齡，雄性，體重18～22 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[SCXK(粵)2016-0002]。實驗地點為廣東藥科大學(xué)實驗動物中心[SYXK(粵)2016-0125]小鼠飼養(yǎng)在SPF條件下，動物實驗程序批準(zhǔn)號:IACUC-201805036，使用3R原則對待實驗動物。

1.2 主要試劑與儀器

MEM培養(yǎng)基、胰酶消化液和澳洲胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司，熒光素酶底物-D-熒光素鉀鹽購自上海翊圣生物科技有限公司，pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro和psiCHECK-2載體由廣州賽哲生物股份有限公司饋贈。人肝癌細(xì)胞株(HCCLM3)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢)，由本實驗室保存。手術(shù)器械：手術(shù)剪、眼科彎鑷、直鑷，持針鉗、縫合針(4×10)、7-0縫合線均購自廣州速研究生物科技有限公司。主要儀器:熒光倒置相差顯微鏡CKX41FS購自日本Olympus公司，ATP熒光檢測儀Systemsure plus購自美國Hygiena公司，化學(xué)發(fā)光圖片分析系統(tǒng)Tanon5200購自上海天能公司，實時熒光定量PCR儀CFXTM購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 PCR擴(kuò)增Luc基因

根據(jù)載體上Luc基因序列和慢病毒表達(dá)載體上多克隆位點設(shè)計2條特異性引物P1、P2，以載體為模版，引物P1、P2擴(kuò)增Luc基因序列。

1.3.2 構(gòu)建pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro慢病毒重組表達(dá)載體

對PCR擴(kuò)增的Luc基因產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，參照文獻(xiàn)[12]，獲得目的基因Luc，連接到相同酶切的慢病毒表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro，經(jīng)篩選、酶切鑒定后送去測序。

1.3.3 Luc-GFP標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞HCCLM3-Luc-GFP的構(gòu)建及鑒定

人肝癌細(xì)胞株HCCLM3培養(yǎng)于含10% FBS的MEM培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種，過夜后轉(zhuǎn)染，加入總體積300 μL，含包裝有重組表達(dá)載體病毒液及聚凝胺的培養(yǎng)基，5 h后補(bǔ)加入300 μL新鮮培養(yǎng)基以稀釋聚凝胺，1 d后更換為600μL含病毒液的培養(yǎng)基，3d后觀察細(xì)胞熒光發(fā)光情況。

向轉(zhuǎn)染后的人肝癌細(xì)胞每2d更換含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞篩選并觀察細(xì)胞形態(tài)及熒光發(fā)光情況，調(diào)整細(xì)胞密度為8×105 cell/ mL，進(jìn)行倍比稀釋獲得4個梯度細(xì)胞數(shù)。分別將倍比稀釋的細(xì)胞懸液各取200 μL并加入相同濃度的熒光素酶底物，觀察細(xì)胞熒光發(fā)光情況。

1.3.4 裸鼠原位肝癌模型的構(gòu)建

(1)細(xì)胞懸液注射法：細(xì)胞懸液注射法：取對數(shù)生長期的HCCLM3-Luc-GFP細(xì)胞，胰酶消化調(diào)整細(xì)胞密度為5×107 cell/ mL，將裸小鼠戊巴比妥溶液麻醉，沿左肋緣下方開腹，暴露出肝臟左葉，使用無菌微量進(jìn)樣器分別將10 μL、20 μL細(xì)胞懸液緩慢注射入肝臟，將肝臟輕送回腹腔，縫合腹壁關(guān)腹，每天定時觀察裸小鼠的情況。

(2)腫瘤組織塊植入法：皮下移植瘤的建立：將處于對數(shù)生長期的HCCLM3- Luc -GFP細(xì)胞，胰酶消化調(diào)整細(xì)胞密度為2×107 cell/mL，取100 μL細(xì)胞懸液接種于裸鼠右肢腋下。待皮下瘤有明顯生長，無菌條件下分離皮下腫瘤塊，在無菌生理鹽水中切成 1 mm×1 mm×1 mm備用。瘤組織離體后30 min內(nèi)植入裸鼠肝臟。

(3)肝原位腫瘤組織種植：將裸小鼠戊巴比妥腹腔注射麻醉。沿左肋緣下方開腹，暴露出肝臟左葉，用尖頭眼科鑷沿肝臟包膜刺一隧道，植入上述切好的腫瘤組織塊，將肝臟輕送回腹腔，縫合腹壁關(guān)腹，每天定時觀察裸小鼠的情況。

1.3.5 活體成像觀察荷瘤裸鼠腫瘤生長情況

在裸小鼠原位肝癌植入后第1、2、3、4和 5周 ，按荷瘤裸鼠體重，腹腔注射相應(yīng)體積的戊巴比妥麻醉劑及熒光素酶混懸，分別進(jìn)行生物發(fā)光和綠色熒光下成像，檢測荷瘤裸鼠腫瘤進(jìn)展情況，根據(jù)發(fā)光的強(qiáng)弱比較兩種方法構(gòu)建的裸鼠原位肝癌模型以及不同發(fā)光技術(shù)的差異。

1.3.6 病理解剖觀察荷瘤裸鼠腫瘤形態(tài)及肺轉(zhuǎn)移情況

第7周成像結(jié)束后，戊巴比妥麻醉裸鼠，打開腹腔和胸腔，觀察肝臟腫瘤組織的大體形態(tài)、生長浸潤情況以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。取肺，用Bouin's液固定2 d后，無水乙醇浸泡洗脫12 h，觀察肺轉(zhuǎn)移灶。蘇木素-伊紅(HE)染色，鏡下觀察肝臟腫瘤和肺轉(zhuǎn)移灶的病理情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增 Luc基因

如圖1所示，有清晰的特異性目的條帶，大小在1.6 kb～1.8 kb 之間，與理論值相符。

2.2 重組表達(dá)載體的鑒定

雙酶切鑒定，得到2個片段(見圖2)，Luc基因在1.6 kb～1.8 kb之間，慢病毒重組表達(dá)載體片段在7.0 kb～10.0 kb之間，酶切結(jié)果與預(yù)期相符。測序結(jié)果目的基因Luc無突變，重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

注：M：Marker；1～4：P1、P2為引物擴(kuò)增的Luc基因片段。圖1 PCR擴(kuò)增Luc基因電泳圖Note. M, Marker. 1-4, amplified Luc gene fragment.Figure 1 PCR amplification of Luc gene electrophoresis

注: M1：Marker；M2： Marker；1～4：慢病毒重組表達(dá)載體、單酶切XbaⅠ、單酶切BamHⅠ、雙酶切XbaⅠ和BamH 。圖2 重組表達(dá)載體酶切鑒定圖Note. M1,Marker.M2,Marker.1,Lentiviral recombinant expression vector without digestion 2,pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro plasmid digested by XbaⅠ. 3,pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro plasmid digested by BamHⅠ. 4,pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro plasmid digested by XbaⅠ and BamH.Figure 2 Identification of recombinant expression vector by enzyme digestion

2.3 pCDH-CMV-Luc-EF1-GFP-Puro轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后熒光鑒定

慢病毒轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞后3 d，在倒置熒光顯微鏡白光下觀察，在白光條件下轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞形態(tài)沒有明顯差異，在激發(fā)光條件下觀察，相比較于未轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后的人肝癌細(xì)胞有明顯綠色熒光且均勻的分布于整個細(xì)胞(見圖3)。

2.4 陽性克隆細(xì)胞株熒光素酶活性分析

將嘌呤霉素抗性篩選后的HCCLM3-Luc-GFP，梯度稀釋后加入相同濃度熒光素酶底物，進(jìn)行熒光素酶活性檢測。結(jié)果顯示(見表1)，轉(zhuǎn)染組熒光相比較于未轉(zhuǎn)染組熒光值明顯提高，并且隨著細(xì)胞密度數(shù)量的增加熒光值也會增加。

2.5 細(xì)胞懸液注射法構(gòu)建裸鼠肝癌模型的活體成像觀察

HCCLM3-Luc-GFP細(xì)胞在裸鼠肝內(nèi)接種(見圖4)后的第1周即可通過活體成像系統(tǒng)檢測到生物發(fā)光信號，隨著時間的延長，熒光信號逐漸增強(qiáng)，在接種后第5 周熒光信號達(dá)到最強(qiáng)，細(xì)胞接種量為10 μL第3 周有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、細(xì)胞接種量為20 μL第1 周有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(見圖5)。

表1 細(xì)胞熒光素酶活性測定

注：未轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)染比較，*P<0.05。

Note. Compared with no-transfection,*P< 0.05.

圖4 肝癌細(xì)胞懸液法原位移植瘤的手術(shù)過程Figure 4 Surgical procedure of establishing liver cancer by liver cancer cell suspension method

注：A：Luc生物發(fā)光檢測；B：GFP綠色熒光檢測。圖5 細(xì)胞懸液接種法的活體成像Note. A, Luc bioluminescence detection；B, GFP green fluorescence detection.Figure 5 In vivo imaging of cell suspension inoculation

2.6 腫瘤組織塊植入法構(gòu)建裸鼠肝癌模型的活體成像觀察

HCCLM3-Luc-GFP細(xì)胞注射到裸鼠腋下皮下，可見明顯皮丘，約10 d左右見瘤體生長，待瘤體直徑至6 mm時，取腫瘤組織進(jìn)行肝原位種植(見圖6)。應(yīng)用Tanon 5200 MμLti 動物活體成像系統(tǒng)檢測荷瘤裸鼠腫瘤動態(tài)變化，接種后的第2 周于種植部位可見生物發(fā)光信號隨著時間的延長即腫瘤的生長而逐漸增強(qiáng)，然而GFP標(biāo)記在肝原位發(fā)光不明顯(見圖7)。

2.7 腫瘤組織實體觀察

肝原位腫瘤生長5周后，處死裸小鼠，解剖暴露肝，發(fā)現(xiàn)兩種方法肝上都有質(zhì)地較硬顏色灰白色的腫瘤組織，如圖8A所示：肝臟表面有多個病灶且體積小，腫瘤塊均勻分布于肝，圖8B所示肝臟表面病灶單一且體積大，幾乎覆蓋于整個肝，腫瘤聚集生長不能滲透于整個肝。肺組織顏色發(fā)現(xiàn)，黃色的肺組織中有白色腫瘤轉(zhuǎn)移灶見圖8C，圖9 HE染色結(jié)果顯示，肝臟原位腫瘤和肺轉(zhuǎn)移可見腫瘤結(jié)節(jié)。

3 討論

裸鼠原位肝癌模型一直以來都是肝癌研究領(lǐng)域的重要工具，對于肝癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移機(jī)制研究及抗肝癌新途徑的探索都具有重要的應(yīng)用價值[13-14]。目前，構(gòu)建裸鼠原位肝癌模型的方法主要有腫瘤組織塊植入法和細(xì)胞混懸液接種法[15-16]，但是這些方法都有各自的優(yōu)缺點。本文通過兩種不同的方法成功構(gòu)建肝原位模型，并且成瘤率均為100%，但組織塊接種法只在肝種植部位局部生長；而細(xì)胞懸液法則整葉肝都能成瘤，且有明顯的肝外轉(zhuǎn)移，可能細(xì)胞容易擴(kuò)散，更能模擬出腫瘤生長的微環(huán)境。本課題組在模型構(gòu)建中，發(fā)現(xiàn)50 μL細(xì)胞體積大，肝容易破裂、部分細(xì)胞懸液溢出；建議盡量提高細(xì)胞濃度，減少注射體積，可減少肝損傷，避免腫瘤腹腔內(nèi)廣泛種植。

本文研究了細(xì)胞懸液注射法和腫瘤組織塊植入法兩種方法建立的高轉(zhuǎn)移性人肝癌細(xì)胞裸鼠原位肝癌模型腫瘤生長和轉(zhuǎn)移情況，比較了綠色熒光蛋白[17-18]和熒光素酶[19-20]在裸鼠原位肝癌模型中的活體成像效果的差異，本實驗選用了綠色熒光蛋白和熒光素酶作為報告基因，同時用于分子成像，綜合了兩者優(yōu)勢的同時彌補(bǔ)了彼此的不足，為以后研究者在選擇構(gòu)建便于活體觀察且高轉(zhuǎn)移的人肝癌裸鼠模型方面提供了幫助。

圖6 肝癌腫瘤組織塊法移植瘤的手術(shù)過程Figure 6 Surgical procedure of tumor tissue transplantation method for establishing liver cancer

注：A：Luc生物發(fā)光檢測；B：GFP綠色熒光檢測。圖7 腫瘤組織塊法的活體成像Note. A， Luc bioluminescence detection.B, GFP green fluorescence detection.Figure 7 In vivo imaging of tumor tissue transplantation method

注：A:細(xì)胞懸液法種植肝原位腫瘤; B:腫瘤組織塊法種植肝原位腫瘤;C:Bouin’s染色后的組織。圖8 腫瘤實體觀察Note. A, Establishment of liver cancer by liver cancer cell suspension. B, Establishment of liver cancer by tumor tissue transplantation. C, Bouin’s stained lung tissue.Figure 8 Observation of tumor entities

注：A肝臟原位腫瘤; B肝臟腫瘤的肺轉(zhuǎn)移。圖9 腫瘤HE染色Note. A，liver tumor in situ. B,pulmonary metastasis of liver tumors.Figure 9 Tumor HE staining