鄭曉楠，王紅宇，呂湘琳，王茜，齊紅莉、通信作者，安立會(huì)

（1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012）

富營(yíng)養(yǎng)化以藻類過(guò)度生長(zhǎng)為特征，已經(jīng)成為從北美大湖到非洲維多利亞湖，淡水湖、池塘和水庫(kù)中的一個(gè)全球環(huán)境問(wèn)題[1]。其中，太湖是中國(guó)典型的富營(yíng)養(yǎng)化湖泊，每年夏秋兩季都會(huì)出現(xiàn)藍(lán)藻的大量繁殖[2]。藍(lán)細(xì)菌會(huì)釋放各種毒素，例如微囊藻毒素（microcystins，MCs），其可在藍(lán)藻生命周期中持續(xù)釋放[3]，從而不斷繁殖并富集在湖泊中，因此會(huì)對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定構(gòu)成極大威脅[4]。

環(huán)境標(biāo)志物是評(píng)價(jià)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)的有效工具[5]，腹足類作為淡水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是水生生態(tài)系統(tǒng)的主要消費(fèi)者，其可被用作評(píng)估藻類毒素造成生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的環(huán)境指示生物[6]，對(duì)于維持特定的生態(tài)過(guò)程是必不可少的[7]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于藍(lán)藻毒素的研究主要集中于對(duì)魚類生殖和子代發(fā)育的影響[8-10]，關(guān)于藻毒素對(duì)腹足類性腺發(fā)育的研究較少[6，11]。

紋沼螺（Parafossarulus striatulus）隸屬于軟體動(dòng)物門（Mollusca），腹足綱（Gastropoda），豆螺科（Bithyniidae），沼螺屬（Parafossarulus），是一種典型的淡水螺類，其廣泛分布于中國(guó)和越南，大多棲身在湖泊和池塘中。本文研究了太湖水域4個(gè)位點(diǎn)紋沼螺在水華期和非水華期雌、雄生殖系統(tǒng)的外部形態(tài)和組織學(xué)特征，旨在探討藍(lán)藻水華期的紋沼螺生殖系統(tǒng)在外部形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)方面的變化，為研究藍(lán)藻毒素對(duì)紋沼螺性腺畸變的機(jī)理提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采集地

本次試驗(yàn)的樣品主要采自太湖水域的4個(gè)采樣點(diǎn)，分別為蘇州灣（N31°05′～31°13′，E120°20′～120°29′），梅梁灣（N31°25′～31°35′，E120°07′～120°13′），竺山灣（N31°20′～31°30′，E119°54′～120°00′），貢湖（N31°20′～31°29′，E120°13′～120°25′）。

1.2 試驗(yàn)取材和方法

將采樣的活體樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，對(duì)紋沼螺進(jìn)行地點(diǎn)分類。調(diào)查樣品選用紋沼螺的成熟個(gè)體若干，用小鐵錘將螺殼敲破，取出軟體部分，沿腮下腺剪開(kāi)外套膜，辨別雌雄性別[12]。樣品用Bouin固定，對(duì)所取的個(gè)體組織采用常規(guī)石蠟切片法制作切片，經(jīng)逐級(jí)脫水、透蠟、包埋、連續(xù)切片和HE染色，最后將紋沼螺生殖系統(tǒng)的組織切片在生物顯微鏡（Olympus CX21）下觀察，并用數(shù)字掃描顯微鏡（Motic BA600）觀察細(xì)胞清晰且顏色正常的切片，使用麥克奧迪數(shù)字切片掃描器系統(tǒng)1.0版本觀察拍照，后期用Adobe Photoshop CC 2014對(duì)圖像進(jìn)行分析處理，性畸變個(gè)體的畸變程度根據(jù)Oehlmann等[13]的方法進(jìn)行劃分。

2 結(jié)果與分析

2.1 太湖水域藍(lán)藻水華期與非水華期紋沼螺的外部形態(tài)

通過(guò)觀察紋沼螺外部的形態(tài)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)前列腺、精巢、陰莖和輸精管等器官構(gòu)成了雄性紋沼螺的生殖系統(tǒng)，精巢一般呈黃色，生長(zhǎng)在內(nèi)臟團(tuán)的頂端，緊貼肝臟，并隨肝臟螺旋轉(zhuǎn)動(dòng)。前列腺一般呈棕黃色，與輸精管相連，是精子從生精細(xì)管出發(fā)輸送到集合管連接外套腔膨大的部位。輸精管呈線性狀突起，位于前列腺過(guò)外套膜邊緣到陰莖基部。陰莖一般呈黑色或灰黑色，生長(zhǎng)于足部右側(cè)，基部較寬，在陰莖內(nèi)部的輸精管延伸部分具有多個(gè)陰莖導(dǎo)管（如圖1A所示）。通過(guò)對(duì)比水華期和非水華期雄性紋沼螺陰莖的位置可發(fā)現(xiàn)，水華期紋沼螺為單陰莖且沒(méi)有陰莖導(dǎo)管（如圖1B所示），兩者易區(qū)分。

圖1 紋沼螺生殖系統(tǒng)的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)

雌性紋沼螺的生殖系統(tǒng)主要由卵巢、輸卵管、納精囊、卵囊腺、生殖孔等組織器官組成，其卵巢的形態(tài)結(jié)構(gòu)與精巢相似，位于雄性紋沼螺精巢相應(yīng)的位置。輸卵管是從卵巢靠近殼軸側(cè)發(fā)出的白色組織，納精囊位于卵囊腺的左后方，卵囊腺沿外套腔右部出發(fā)，一般呈透明狀，生殖孔的位置臨近肛門處（如圖1C所示）。非水華期雌性紋沼螺與水華期紋沼螺外部形態(tài)上差別不明顯（如圖1D所示）。

2.2 太湖水域4個(gè)采樣點(diǎn)藍(lán)藻水華期與非水華期紋沼螺的性腺組織結(jié)構(gòu)

2.2.1 蘇州灣（SZ）藍(lán)藻水華期與非水華期紋沼螺的性腺組織結(jié)構(gòu)

通過(guò)觀察蘇州灣藍(lán)藻非水華期雄性紋沼螺的組織學(xué)切片，發(fā)現(xiàn)精巢接近半月型，細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯（如圖2A所示）?；らg精原細(xì)胞近橢圓形，細(xì)胞核卵圓形，核大，核內(nèi)零散分布一些嗜堿性被染成藍(lán)紫色的顆粒，數(shù)量較多且排列規(guī)則。初級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)精原細(xì)胞分裂而成，細(xì)胞近圓形，大量分布在管腔內(nèi)，胞膜不明顯，核較大，染色質(zhì)著色較深。精細(xì)胞近圓形，經(jīng)次級(jí)精母細(xì)胞第二次成熟分裂形成，較精母細(xì)胞略小，數(shù)量較精母細(xì)胞減少，核經(jīng)蘇木素染色后最深。輸精小管內(nèi)精子呈桿狀，成熟的精子尾端似鞭毛，可被染成藍(lán)紫色且排布均勻。在其精巢中各階段的生殖細(xì)胞數(shù)量與水華期雄性紋沼螺比較相對(duì)較多，且生殖細(xì)胞排列規(guī)律（如圖2B所示）。

圖2 蘇州灣（SZ）藍(lán)藻水華期與非水華期紋沼螺的性腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)（H&E）

由蘇州灣藍(lán)藻水華期雄性紋沼螺切片可觀察到精巢內(nèi)生殖細(xì)胞的結(jié)構(gòu)不清晰（如圖2C所示）。圖2D顯示，分布在基膜間的精原細(xì)胞間隙較大，對(duì)比非水華期雄性紋沼螺的數(shù)量明顯降低。初級(jí)精母細(xì)胞零散的分布在管腔中，個(gè)體較小且在數(shù)量上極顯著減少。精細(xì)胞散落在細(xì)胞質(zhì)中，個(gè)體不大且數(shù)量變少。精子的形狀和大小與非水華期雄性紋沼螺對(duì)比無(wú)明顯差異，但在數(shù)量上有所減少。精巢中各階段生殖細(xì)胞與非水華期雄性紋沼螺相比，排列不規(guī)律、個(gè)體均偏小、數(shù)量均偏少。

由蘇州灣藍(lán)藻水華期雌性紋沼螺切片可觀察到整個(gè)卵巢的最外層由結(jié)締組織包裹，可觀察到其細(xì)胞結(jié)構(gòu)（如圖2E所示）。藍(lán)藻非水華期雌性紋沼螺的生殖細(xì)胞結(jié)構(gòu)均清晰可見(jiàn)且分布均勻，與水華期在結(jié)構(gòu)上沒(méi)有明顯差別（如圖2F所示），卵巢豐滿，可見(jiàn)卵泡呈空白圓形且均勻分布在間質(zhì)中。卵原細(xì)胞分布在濾泡壁的基底膜上，呈圓形，核大，細(xì)胞質(zhì)著色較深。成熟卵母細(xì)胞的形狀由于細(xì)胞間相互擠壓而不規(guī)則，核大且偏離細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)著色淺，核膜清晰可見(jiàn)。各階段性腺細(xì)胞大小正常，分布整齊。

2.2.2 梅梁灣（ML）藍(lán)藻水華期與非水華期紋沼螺的性腺組織結(jié)構(gòu)

通過(guò)梅梁灣藍(lán)藻水華期雄性紋沼螺切片可觀察到，其各階段生殖細(xì)胞的形態(tài)與蘇州灣水華期雄性紋沼螺生殖細(xì)胞極相似，且數(shù)量比例也大體一致。在輸精小管內(nèi)可見(jiàn)零散的精子，成熟的精子頭部被深度染色（如圖3B所示）。

圖3 梅梁灣（ML）藍(lán)藻水華期與非水華期紋沼螺的性腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)（H&E）

如圖3C所示，與梅梁灣藍(lán)藻水華期雄性紋沼螺的精巢組織切片相比，梅梁灣藍(lán)藻非水華期紋沼螺精巢中各階段生殖細(xì)胞不僅在數(shù)量上有明顯的優(yōu)勢(shì)，且在細(xì)胞形態(tài)上也較其清晰，精巢內(nèi)細(xì)胞規(guī)律分布（如圖3D所示）。

通過(guò)梅梁灣藍(lán)藻非水華期雌性紋沼螺的切片可觀察到，卵巢被疏松的結(jié)締組織包裹，其各階段生殖細(xì)胞的結(jié)構(gòu)明顯。卵原細(xì)胞呈卵圓形，核大。卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)嗜酸性，被H.E染紅；細(xì)胞核嗜堿性，被染成藍(lán)紫色（如圖3F所示）。梅梁灣藍(lán)藻水華期雌性紋沼螺的切片中可清晰地觀察到卵泡、卵原細(xì)胞、卵母細(xì)胞等生殖細(xì)胞的結(jié)構(gòu)（如圖3E所示），因此兩者無(wú)明顯差別。

2.2.3 竺山灣（ZS）藍(lán)藻水華期與非水華期紋沼螺的性腺組織結(jié)構(gòu)

通過(guò)觀察竺山灣藍(lán)藻水華期雄性紋沼螺切片可發(fā)現(xiàn)，精巢呈團(tuán)狀，最外層為單層立方上皮。如圖4B所示，精原細(xì)胞輪廓清晰，核大呈卵圓形，精原細(xì)胞和精母細(xì)胞的形態(tài)差異較大，易區(qū)分。精母細(xì)胞的數(shù)量較少，精細(xì)胞和精子的數(shù)量較非水華期也有所減少，輸精小管內(nèi)的成熟精子頭部被染成藍(lán)紫色，尾巴似鞭毛且排列無(wú)規(guī)律。

圖4 竺山灣（ZS）藍(lán)藻水華期與非水華期紋沼螺的性腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)（H&E）

從竺山灣藍(lán)藻非水華期雄性紋沼螺的切片中可發(fā)現(xiàn)，精巢的結(jié)構(gòu)較水華期更完整、清晰（如圖4C所示），精巢中各階段生殖細(xì)胞的數(shù)量也比水華期雄性紋沼螺數(shù)量多，且排列規(guī)則（如圖4D所示）。

從圖4E中可發(fā)現(xiàn)，竺山灣藍(lán)藻水華期雌性紋沼螺中的卵母細(xì)胞個(gè)體差別較大，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性，經(jīng)H.E染成紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)紫色，核仁較大。卵原細(xì)胞呈圓形，分布在濾泡壁的基底膜上。竺山灣藍(lán)藻非水華期雌性紋沼螺的卵巢被結(jié)締組織包裹，各階段性腺細(xì)胞的大小正常，分布整齊，卵泡、卵原細(xì)胞、卵母細(xì)胞等排列均勻且清晰可見(jiàn)（如圖4F所示）。

2.2.4 貢湖（GH）藍(lán)藻水華期與非水華期紋沼螺的性腺組織結(jié)構(gòu)

通過(guò)貢湖藍(lán)藻水華期雄性紋沼螺的切片可觀察到，基膜間精原細(xì)胞近橢圓形，其胞內(nèi)含有小顆粒，同細(xì)胞核均被染成藍(lán)紫色，核仁著色較深。精母細(xì)胞的細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，嗜堿性，經(jīng)蘇木素染成藍(lán)紫色。精細(xì)胞較精母細(xì)胞的個(gè)體略小，但兩者數(shù)量極少。精子分布均勻，數(shù)量少（如圖5B所示）。

圖5 貢湖（GH）藍(lán)藻水華期與非水華期紋沼螺的性腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)（H&E）

通過(guò)貢湖藍(lán)藻非水華期雄性紋沼螺的切片可發(fā)現(xiàn)，其精巢內(nèi)生殖細(xì)胞的結(jié)構(gòu)均飽滿且染色清晰，細(xì)胞分布規(guī)律。藍(lán)藻水華期雄性紋沼螺各階段生殖細(xì)胞的數(shù)量次之，且個(gè)體較?。ㄈ鐖D 5D所示）。

從貢湖藍(lán)藻水華期雌性紋沼螺切片中可觀察到，整個(gè)卵巢豐滿，被包裹在疏松的結(jié)締組織中，卵原細(xì)胞呈橢圓形，胞內(nèi)小顆粒被染成藍(lán)紫色，核大且圓。各階段生殖細(xì)胞的結(jié)構(gòu)染色均清晰（如圖5E所示）。從貢湖藍(lán)藻水華期雌性紋沼螺的切片中可清晰地觀察到卵泡、卵原細(xì)胞、卵母細(xì)胞等生殖細(xì)胞的結(jié)構(gòu)（如圖5F所示），因此兩者無(wú)明顯差別。

3 討論

3.1 太湖藍(lán)藻水華期對(duì)紋沼螺外部形態(tài)結(jié)構(gòu)和性腺組織結(jié)構(gòu)的影響

本試驗(yàn)通過(guò)觀察太湖水域4個(gè)采樣點(diǎn)紋沼螺的外部形態(tài)及性腺組織切片發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻水華期釋放出的藍(lán)藻毒素不僅會(huì)導(dǎo)致雄性紋沼螺的陰莖導(dǎo)管缺失，而且其精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子數(shù)量的減少都呈現(xiàn)出畸變的現(xiàn)象。此現(xiàn)象可能是因?yàn)楹此w富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致藍(lán)藻大量繁殖，造成藍(lán)藻水華周期性爆發(fā)，藍(lán)藻會(huì)釋放各種毒素，從而不斷繁殖并富集在湖泊中[14]。藍(lán)藻毒素是內(nèi)分泌干擾素的一種，可產(chǎn)生維甲酸[15]，維甲酸對(duì)動(dòng)物有很強(qiáng)的致畸作用。因此，當(dāng)毒素被攝入到生物體體內(nèi)時(shí)，不僅會(huì)影響生物的正常生理活動(dòng)，還會(huì)導(dǎo)致生物發(fā)生畸變等異?，F(xiàn)象[16]。本試驗(yàn)結(jié)果與楊濤等[17]關(guān)于微囊藻毒素對(duì)水生動(dòng)物生殖系統(tǒng)影響的研究結(jié)果基本一致，當(dāng)微囊藻毒素被攝入到水生動(dòng)物體內(nèi)后，水生動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢等不同程度的不良影響，嚴(yán)重的可直接影響生物性腺發(fā)育情況、降低其后代的個(gè)體質(zhì)量。本文發(fā)現(xiàn)，太湖藍(lán)藻水華期較非水華期雌性紋沼螺外部形態(tài)和性腺組織差別不明顯，與王雅琴等[18]的研究結(jié)果基本一致，多種環(huán)境雌激素長(zhǎng)期暴露可有效降低斑馬魚精子的數(shù)量，而其對(duì)雌性斑馬魚的性腺發(fā)育沒(méi)有影響。環(huán)境雌激素具有強(qiáng)烈的雌激素效應(yīng)[18]，環(huán)境釋放出來(lái)的劑量可阻礙無(wú)脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育，誘導(dǎo)魚類、蛙類等發(fā)生“雌化”[19-21]。因此，關(guān)于太湖藍(lán)藻水華期對(duì)紋沼螺外部其他組織結(jié)構(gòu)的變化和性腺組織發(fā)育的影響機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3.2 太湖水域4個(gè)采樣點(diǎn)紋沼螺性腺組織畸變程度的比較

通過(guò)觀察太湖水域4個(gè)采樣點(diǎn)水華期與非水華期紋沼螺性腺的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻水華期雄性紋沼螺精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子的數(shù)量較非水華期均有不同程度的減少趨勢(shì)。在藍(lán)藻水華期，蘇州灣和梅梁灣2個(gè)采樣點(diǎn)的雄性紋沼螺的性畸變程度差別不明顯，但高于竺山灣，性畸變程度最低的是貢湖。這與成厚城[22]進(jìn)行的微囊藻毒素-LR對(duì)斑馬魚生殖和子代發(fā)育影響的研究結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)，微囊藻毒素水平的升高可導(dǎo)致斑馬魚性腺畸變率升高，其產(chǎn)卵量呈顯著下降的趨勢(shì)。Muenpo[23]研究了 5種不同濃度的TBT誘導(dǎo)方斑東方螺（Babylonia areolata）配子的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)雌性方斑東方螺發(fā)生不同程度的性畸變現(xiàn)象。本試驗(yàn)太湖4個(gè)位點(diǎn)水華期雄性紋沼螺的性畸變程度不同可能與4個(gè)采樣點(diǎn)的藻毒素濃度有關(guān)，關(guān)于藻毒素種類及濃度對(duì)紋沼螺性腺畸變機(jī)制的研究仍需進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)組織解剖學(xué)和常規(guī)石蠟切片的方法，研究了太湖水域4個(gè)位點(diǎn)紋沼螺在藍(lán)藻水華期生殖系統(tǒng)的外部形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)方面的變化，為藻毒素對(duì)淡水螺類性腺畸變的機(jī)理研究提供組織學(xué)方面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)進(jìn)一步豐富生態(tài)毒理學(xué)具有重大意義。同時(shí)由于采樣時(shí)間的局限性并未觀察到生殖細(xì)胞在功能上發(fā)生的異常，也未深入剖析是否具有遺傳毒性，藍(lán)藻毒素等污染物在紋沼螺體內(nèi)的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究和探索。