桑赫男

(撫順市中心醫(yī)院檢驗科，遼寧撫順113006)

膀胱癌是臨床上常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，主要發(fā)生于膀胱黏膜的上皮，是常見惡性腫瘤之一[1]。膀胱癌的發(fā)病原因可能與遺傳和外在環(huán)境有關(guān)[2]，但是其確切的發(fā)病機制目前尚不明確[3]。肺腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1)為長鏈非編碼RNA(lncRNA)的重要成員，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，其與腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡過程密切相關(guān)[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)過程，且其表達(dá)異常與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。BIU-87細(xì)胞來源于人膀胱乳頭狀移行上皮癌，為上皮樣貼壁細(xì)胞。本研究旨在分析RNA干擾MALAT1是否通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，從而影響膀胱癌細(xì)胞系BIU-87的細(xì)胞增殖，以期為膀胱癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系、主要試劑及儀器 膀胱癌細(xì)胞系BIU-87購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；MALAT1-RNAi表達(dá)載體(由本實驗室保存)；RPMI培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；MTT試劑(美國Sigma Aldrich公司)；兔抗人MMP2抗體(美國R&D公司)；兔抗人MMP9抗體(美國Santa Cruz公司)；兔抗人TIMP1及兔抗人TIMP2抗體(美國Cell Signaling公司)；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠/羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋公司)；其余試劑為市售分析純。電泳槽、電泳儀及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)均購自美國ABI公司；Multiskan Sky紫外分光光度儀(美國賽默飛世爾公司)。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取生長狀態(tài)良好的膀胱癌細(xì)胞系BIU-87，分別設(shè)為空白對照組(n=8)、陰性對照組(n=8)和轉(zhuǎn)染組(n=8)，其中空白對照組細(xì)胞不進(jìn)行處理，陰性對照組細(xì)胞僅轉(zhuǎn)染空載體，轉(zhuǎn)染組構(gòu)建MALAT1-RNAi表達(dá)載體(細(xì)胞融合度達(dá)80%時，室溫溫育20 min，轉(zhuǎn)染復(fù)合物置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)基)。分別收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，加入含青霉素(終濃度100 U/mL)、鏈霉素(終濃度100 U/mL)和FBS(終濃度10%)的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2、95%相對濕度恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24及48 h，收集細(xì)胞并用于后續(xù)試驗。

1.3MTT試驗 取上述3組培養(yǎng)12、24和48 h后的細(xì)胞(細(xì)胞融合度達(dá)80%)，棄去培養(yǎng)液，分別加入200 μL MTT溶液，繼續(xù)溫育4 h，采用Multiskan Sky紫外分光光度儀檢測490 nm處的吸光度(A490 nm)值，并計算各組細(xì)胞的抑制率。公式：抑制率=(對照組A490 nm值-試驗組A490 nm值)/對照組A490 nm值×100%。

1.4細(xì)胞蛋白質(zhì)提取 收集1.2中轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞(各3×105個)，無菌PBS(4 ℃預(yù)冷)洗滌2次，800×g離心5 min去除上清，吸凈殘留液體，加入含1%蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，并于冰水浴中進(jìn)行充分研磨勻漿。采用考馬斯亮藍(lán)法測定樣本的蛋白質(zhì)濃度。然后加入1/3體積的4×SDS蛋白質(zhì)上樣緩沖液，煮沸10 min，分裝并置-20 ℃保存。

1.5western blot 配制10% SDS-PAGE分離膠，按總蛋白量200 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(積層膠采用80 V電壓，分離膠采用100 V電壓)。電泳結(jié)束后在350 mA恒流條件下2 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC)上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜置于50 g/L脫脂奶粉中室溫封閉4 h，加入兔抗人MMP2抗體(1∶400稀釋)、兔抗人MMP9抗體(1∶500稀釋)、兔抗人TIMP1及TIMP2抗體(1∶500稀釋)溫育過夜。無菌PBS洗膜3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠/羊抗兔IgG二抗(1∶200稀釋)37 ℃溫育2 h。無菌PBS洗膜后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)及配套軟件對條帶進(jìn)行灰度掃描及結(jié)果判讀，以β-actin蛋白作為內(nèi)參照，試驗重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞劃痕試驗 收集轉(zhuǎn)染后的3組BIU-87細(xì)胞(約3×105個)，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入含青霉素(終濃度100 U/mL)、鏈霉素(終濃度100 U/mL)和FBS(終濃度10%)的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時，更換無血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每個細(xì)胞培養(yǎng)孔用Tips移液槍頭劃出3道豎線，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照0 h時的細(xì)胞形態(tài)。以按照1.2處理24 h后的細(xì)胞形態(tài)作為計算遷移率的終點狀態(tài)。根據(jù)劃痕面積，采用Image J軟件計算細(xì)胞遷移率。

2 結(jié)果

2.1lncRNA MALAT1對BIU-87細(xì)胞增殖的影響 與空白對照組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組膀胱癌細(xì)胞系BIU-87的增殖能力受到明顯抑制(P<0.05)，且隨著作用時間的延長，其抑制率明顯升高(P<0.05)，見表1。此外，與空白對照組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移能力明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.657，P=0.000)，見圖1。

表1 lncRNA MALAT1對BIU-87細(xì)胞增殖能力的影響

注：*，與空白對照組相比，P<0.05；#，與陰性對照組相比，P<0.05。

注：*，與空白組相比，P<0.05；#，與陰性組相比，P<0.05。

圖1 3組細(xì)胞遷移能力檢測結(jié)果

2.2lncRNA MALAT1對基質(zhì)金屬蛋白酶及抑制劑表達(dá)的影響 western blot檢測結(jié)果表明，與空白對照組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2及MMP9蛋白的表達(dá)水平明顯減弱(P<0.05)。此外，與空白對照組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP1及TIMP2的表達(dá)水平亦明顯減弱(P<0.05)，見表2、圖2。

圖2 western blot檢測3組細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑蛋白的表達(dá)

表2 lncRNA MALAT1對BIU-87細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑表達(dá)變化分析

指標(biāo)空白對照組陰性對照組轉(zhuǎn)染組FPMMP20.56±0.140.55±0.120.30±0.07?#28.4750.003MMP90.48±0.090.49±0.100.36±0.07?#33.6450.001TIMP10.44±0.100.43±0.080.32±0.09?#36.7540.002TIMP20.47±0.070.48±0.110.39±0.09?#25.8250.004

注：*，與空白對照組相比，P<0.05；#，與陰性對照組相比，P<0.05。

3 討論

目前尚未完全闡明膀胱癌發(fā)病的分子機制，臨床上也無特效的治療手段，但有證據(jù)顯示MALAT1與腫瘤的侵襲能力等有關(guān)。最新的研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MALAT1可靶向促進(jìn)miR-146b-5p表達(dá)，抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲、遷移能力和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[5]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，MALAT1與miR-205之間存在雙向抑制關(guān)系，MALAT1可通過抑制miR-205的表達(dá)來促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲[6]。莫美絨等[7]研究表明，LncRNA MALAT1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)lncRNA MALAT1可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和侵襲，并證實其作用機制可能與MMP-2及pERK1/2蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。趙志新等[8]通過實驗證實，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MALAT1可通過調(diào)控miRNA124的表達(dá)，引起CREB基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的升高，從而促進(jìn)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果也表明，與空白對照組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組膀胱癌細(xì)胞系BIU-87的增殖受到明顯抑制，且隨著作用時間的延長其抑制率明顯升高，提示RNA干擾MALAT1可能通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，影響膀胱癌細(xì)胞系BIU-87的增殖功能。

基質(zhì)金屬蛋白酶是調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的關(guān)鍵酶，其參與調(diào)控了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和凋亡等過程[9]。本研究結(jié)果亦證實，轉(zhuǎn)染組膀胱癌細(xì)胞系BIU-87的基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的表達(dá)水平明顯減弱。然而，本研究未對MMPs/TIMPs蛋白活性進(jìn)行研究，在今后的研究中，我們將進(jìn)一步采用明膠酶譜等試驗進(jìn)行相關(guān)蛋白質(zhì)的活性分析，同時采用相關(guān)的抑制劑和基因敲除技術(shù)進(jìn)行基因?qū)用娴臋z測分析，以期為相關(guān)機制的探討提供更多思路，為更準(zhǔn)確闡明lncRNA MALAT1的作用機制提供實驗依據(jù)。