馬永青，王璐，劉穎，劉永利

摘要：為明確杜仲顆粒生產(chǎn)過程中水溶性成分的轉(zhuǎn)移情況，提供更為全面的質(zhì)量控制方法，采用HPLC法對杜仲飲片、杜仲葉飲片、標準煎液與杜仲顆粒的特征圖譜進行了相關(guān)性評價。使用Phenomenex（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈0.1%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為227 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，考察提取方式、提取溶劑及時間的影響。結(jié)果表明，選用超聲提取方式，以甲醇作為提取溶劑，反應時間為20 min時獲得的效果較好;在此優(yōu)化條件下建立特征圖譜分析方法，能夠使得杜仲顆粒的藥效物質(zhì)基礎與藥材保持一致，樣品質(zhì)量穩(wěn)定，制備工藝規(guī)范，幾個特征峰可全部在飲片中得到追溯，各共有峰的相對保留時間小于0.5%。所建立的特征圖譜專屬性強，重復性好，可有效鑒別和評價杜仲顆粒的質(zhì)量，為制定系列品種的全面質(zhì)量控制方法提供參考。

關(guān)鍵詞：中藥化學;高效液相色譜法;杜仲飲片;杜仲葉飲片;杜仲顆粒;特征圖譜

中圖分類號：R917文獻標識碼：Adoi： 10.7535/hbgykj.2020yx01010

Characteristic chromatogram of Duzhong granules on

whole process quality control concept

MA Yongqing1， WANG Lu1， LIU Ying2， LIU Yongli1

（1. Hebei Institute for Drug Control， Shijiazhuang， Hebei 050011， China;2. Hebei Province for Food and Drug Evaluation Certification Center， Shijiazhuang， Hebei 050011， China）

Abstract：In order to clarify the transfer of watersoluble components in the production process of Duzhong granules and provide a more comprehensive quality control method， HPLC method is used to evaluate the correlation between the characteristic maps of Eucommiae Cortex，Eucommiae Folium，standard decoction and Duzhong granules. The analysis is performed on Phenomenex C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， with acetonitrile0.1% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase for gradient elution. The detection wavelength is set at 227 nm， the column temperature is maintained at 30 ℃ and flow rate is 1.0 mL/min. The effects of extraction method， extraction solvent and reaction time are investigated. The results show that the ultrasonic extraction method is selected， methanol is used as the extraction solvent， and the reaction time is 20 minutes. The analysis method of Duzhong granules characteristic map is established under the optimized conditions. The effective substance basis of Duzhong granules is consistent with that of medicinal materials， the sample quality is stable， the preparation process is standard， several characteristic peaks could be traced all in the decoction pieces， and the relative retention time of each common peak is small at 0.5%. The established characteristic map has strong specificity and good repeatability， which can effectively identify and evaluate the quality of Duzhong granules， and provide a certain reference for the quality detection methods of a series of varieties.

Keywords：chemistry of Chinese material medica;HPLC; Eucommiae Cortex; Eucommiae Folium; Duzhong granules; characteristic chromatogram

杜仲與杜仲葉分別為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥樹皮、干燥葉，具有補肝腎、強筋骨、安胎之功效，用于肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈目眩、胎動不安等癥的治療[1]。目前針對不同產(chǎn)地杜仲及杜仲葉中主要有效成分含量的報道較多[23]。杜仲飲片及杜仲葉飲片HPLC指紋圖譜的初步建立，可有效控制藥材的內(nèi)部質(zhì)量[45]。另外，研究發(fā)現(xiàn)鹽制過程對杜仲中環(huán)烯醚萜類及木脂素類成分的影響明顯[6]。中成藥質(zhì)量影響因素較多，如原藥材質(zhì)量、投料飲片質(zhì)量、提取制備工藝等。已有文獻報道的質(zhì)量控制多集中在對成品質(zhì)量標準的研究上[712]，對杜仲顆粒質(zhì)量全程控制的研究鮮有報道。

中藥特征圖譜技術(shù)能夠表征中藥整體質(zhì)量信息，反映中藥復雜的化學成分，在有效成分尚未完全闡明的情況下，有效表征中藥質(zhì)量，適用于控制中藥生產(chǎn)過程各環(huán)節(jié)中間體及成品質(zhì)量[1317]。本研究采用HPLC法建立杜仲顆粒的特征圖譜，考察杜仲顆粒生產(chǎn)過程重要環(huán)節(jié)中藥材和杜仲顆粒水溶性成分的轉(zhuǎn)移情況。

1主要儀器與試藥

1.1儀器

Waters e2695色譜儀（美國Waters公司）;MilliQ超純水機（美國Millipore公司）;TOLEDO XS105電子分析天平（瑞士Mettler公司）。

1.2試藥

松脂醇二葡萄糖苷（中國食品藥品檢定研究院提供，批號為111537200501）;綠原酸（中國食品藥品檢定研究院，批號為110753201415，含量以962%計）;杜仲顆粒，規(guī)格為每袋裝5 g;乙腈（色譜純，Merck KGaA公司提供）;其他試劑均為分析純;10批杜仲顆粒樣品由生產(chǎn)廠家提供。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Phenomenex（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：以乙腈為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B;采用梯度洗脫方式：0～5 min，5%A;5～30 min，5%→15%A;30～45 min，15%→20%A;柱溫：30 ℃;流速：1 mL/min;檢測波長：227 nm。

2.2溶液制備

2.2.1混合對照品溶液

取綠原酸對照品、松脂醇二葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含綠原酸150 μg、松脂醇二葡萄糖苷20 μg的混合溶液，即得。

2.2.2杜仲顆粒供試品溶液

取本品內(nèi)容物，研細，取約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）20 min。放冷，搖勻，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3杜仲飲片、杜仲葉飲片與標準煎液供試品溶液

取杜仲飲片、杜仲葉飲片及處方藥味（杜仲對照藥材0.5 g、杜仲葉對照藥材2.5 g混勻），加水煎煮1 h，離心，取上清液加2.8倍乙醇使其沉淀。再次離心，將上清液調(diào)整至約30 mL，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

3方法學考察

3.1杜仲顆粒特征圖譜的建立及分析

取10批杜仲顆粒，按“2.2.2”項所述方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行分析，確定色譜圖中出峰時間基本一致、峰面積較大的5個峰為共有特征色譜峰。通過與對照品比對，確認2號峰為綠原酸，4號峰為松脂醇二葡萄糖苷。其中2號峰峰形較好，前后無雜質(zhì)峰干擾，分離完全，出峰時間居中，選其作為參考峰，見圖1。

此外，通過比較杜仲顆粒與原藥材HPLCDAD的色譜圖，明確了1號—3號共有峰來源于杜仲與杜仲葉，4號共有峰來源于杜仲，5號共有峰來源于杜仲葉。將杜仲飲片、杜仲葉飲片、標準煎液、杜仲顆粒圖譜進行比較可知，與杜仲、杜仲葉藥材指標成分相關(guān)的主要色譜峰在標準煎液及杜仲顆粒色譜圖中均能得到體現(xiàn);同時，杜仲顆粒中主要色譜峰也能在藥材提取物圖譜中得到追溯。10批杜仲顆粒HPLC特征色譜，以及杜仲飲片、杜仲葉飲片及標準煎液的HPLC色譜圖見圖2—圖3。

3.2重復性試驗

取同一批樣品，研細，各取1，2，3 g共3份，按“2.2.2”項所述方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行測定。結(jié)果表明，本方法保留時間的重復性良好，結(jié)果見表1和表2。

3.3穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項制備的供試品溶液，分別放置0，8，16，24 h后，按“2.1”項色譜條件進行分析，以綠原酸為參照峰，計算特征圖譜中各共有峰的相對保留時間。結(jié)果顯示，各共有峰的相對保留時間小于05%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

4討論

4.1檢測波長的選擇

杜仲顆粒成分復雜，主要有效成分紫外吸收差異較大。為保證各共有峰具有適宜的靈敏度和精密度，采用二極管陳列PDA檢測器在200～400 nm下進行各波長掃描。結(jié)果表明，在227 nm處基線穩(wěn)定，各共有峰在同一波長下均有較好的吸收，干擾較小，且低含量組分松脂醇二葡萄糖苷的檢測靈敏度好，峰型好。

4.2提取方法的選擇

通過實驗比較了甲醇、70%甲醇、水、乙醇4種提取溶劑的提取效果。結(jié)果表明，采用甲醇作為提取溶劑時所得色譜峰的分離效果較好，響應值較高。以甲醇作為提取溶劑，對回流和超聲提取方式進行考察的結(jié)果表明，兩者的提取效果并無明顯差異。此外，通過實驗比較了提取時間對提取效果的影響。綜合考慮，確定采用操作簡單的超聲提取方法，以甲醇作為提取溶劑，超聲時間為20 min。

4.3流動相選擇

實驗中比較了甲醇水、乙腈磷酸水等多個流動相系統(tǒng)。結(jié)果顯示，采用乙腈0.1%磷酸溶液時峰型對稱，可獲得較高的理論塔板數(shù)，分離度也都達到要求。因此，選擇乙腈0.1%磷酸溶液作為流動相。

5結(jié)語

1）杜仲、杜仲葉提取物、杜仲顆粒的主要化學成分組成基本一致＼[1819＼]，說明藥材經(jīng)過現(xiàn)代化工藝提取、濃縮等工藝制成顆粒后的主成分與藥材提取物高度相關(guān)，提示杜仲顆粒保留了原料藥中的主要特征成分，藥效物質(zhì)基礎與藥材保持一致。

2）采用標準煎液來標準化杜仲顆粒的質(zhì)量，有助于實現(xiàn)臨床用藥的一致性和安全性。

3）本研究探索杜仲顆粒與其組方藥味杜仲、杜仲葉的藥用物質(zhì)基礎關(guān)系，體現(xiàn)了中藥多成分作用整體性的質(zhì)量控制方法。特征圖譜專屬性強、重復性好，可有效鑒別和評價杜仲顆粒的質(zhì)量，全面體現(xiàn)杜仲顆粒的組成成分，共有峰歸屬的初步確立也為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了依據(jù)，可為建立杜仲顆粒的綜合質(zhì)量標準提供一定的參考。

4）后期研究將進一步指認及明確杜仲顆粒中多種成分的含量及其藥理作用。

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收稿日期：2019521;修回日期：20191021;責任編輯：張士瑩

基金項目：河北省科技計劃項目（16272511）

第一作者簡介：馬永青（1978—），女，河北石家莊人，副主任藥師，博士，主要從事藥物分析及質(zhì)量控制方面的研究。

通訊作者：劉永利主任藥師。Email：liuyongli2008@126.com

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