黃陳 于生蘭 徐加兵

摘要：旨在提出1種新的具有高靈敏度、特異性抗黃芪甲苷（AST）單克隆抗體的純化方法，從而為制備具有類似活性基團(tuán)的其他天然化合物的親和層析樹(shù)脂方法提供參考。用AST與環(huán)氧活化瓊脂糖6B（EAS6B）偶聯(lián)制備的免疫親和柱從小鼠腹水中純化抗AST的高敏單克隆抗體（mAbs），與用G-葡聚糖凝膠從小鼠腹水中純化的抗AST單克隆抗體進(jìn)行比較，通過(guò)間接ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA比較2種方法純化的單克隆抗體，評(píng)價(jià)親和培養(yǎng)基的效用。間接ELISA結(jié)果顯示，用AST-EAS6B柱純化的抗AST單克隆抗體的效價(jià)略高于用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗體效價(jià);間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果顯示，用AST-EAS6B柱純化的抗AST單克隆抗體的結(jié)合抑制50%濃度（IC50）為 0.005 μg/mL，用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗AST單克隆抗體的IC50為0.05 μg/mL，用AST-EAS6B柱純化的抗AST單克隆抗體比用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗AST單克隆抗體對(duì)AST更具有特異性。

關(guān)鍵詞：親和色譜層析介質(zhì);黃芪甲苷;環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠6B;ELISA;SDS-PAGE

中圖分類號(hào)： O657.7 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2020）03-0218-04

目前純化抗體的方法主要包括不同組合的G蛋白純化、離子交換法和排阻色譜技術(shù)等[1]。然而，這些方法有時(shí)不能有效分離出某些特異性抗體[2]。因此，使用這些非特異性純化方法分離的抗體還不能完全滿足許多研究應(yīng)用的要求[3]。免疫親和色譜（IAC）是一種液相色譜，其中固定相由抗體或抗原試劑組成，該技術(shù)代表親和色譜的一個(gè)特殊亞類，其中的生物相關(guān)結(jié)合劑用于選擇性純化或分析目標(biāo)化合物[4]。由于抗體與它們各自的靶標(biāo)能夠選擇性和特異性結(jié)合，這使它們作為親和色譜中的固定配體多年來(lái)倍受關(guān)注。IAC使用的主要方法是利用固定化靶標(biāo)進(jìn)行抗體純化[5]。

黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，簡(jiǎn)稱AST）是中藥黃芪藥理活性的主要物質(zhì)之一，為黃芪及其制劑質(zhì)量鑒定的指標(biāo)成分。藥理研究結(jié)果表明，AST具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、保護(hù)組織器官、降低血糖、抗細(xì)胞凋亡和抗炎抗病毒等多方面的作用，具有非常廣闊的發(fā)展前景[6]。本研究以黃芪甲苷為配體，采用環(huán)氧活化瓊脂糖6B（EAS6B）親和色譜法，從小鼠腹水中純化抗AST單克隆抗體。用間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱ELISA）和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)用AST-EAS6B純化的抗體與用G-葡聚糖親和色譜純化的抗體的效價(jià)和特異性進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

AST標(biāo)準(zhǔn)品，成都曼特生物技術(shù)有限公司（成都）;3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物緩沖液，北京索萊寶科技有限公司（北京）;辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG+[免疫球蛋白（IgG）二抗]，武漢博斯特生物科技有限公司（武漢）;環(huán)氧活化瓊脂糖6B，購(gòu)自Sigma-Aldrich（圣路易斯，美國(guó)）;本研究所用其他化學(xué)藥品均購(gòu)自中國(guó)藥品化學(xué)試劑有限公司（北京）。

AST-卵清蛋白（AST-OVA）和含有抗AST單克隆抗體的小鼠腹水，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備，前期筆者所在研究團(tuán)隊(duì)對(duì)黃芪甲苷人工抗原的合成與評(píng)價(jià)進(jìn)行了研究[7]。

1.2 方法

1.2.1 親和介質(zhì)的制備（AST-EAS6B） AST在固體載體上的共價(jià)偶聯(lián)是根據(jù)制造商對(duì)環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠6B（Sigma-Aldrich）和相關(guān)文獻(xiàn)的說(shuō)明進(jìn)行的。方法如下：將0.2 g EAS6B懸浮在 50 mL 蒸餾水中，在溶脹后（1 g凍干粉末約產(chǎn)生 3.5 mL 最終體積的介質(zhì)），用200 mL蒸餾水洗滌介質(zhì)1 h;將10 mg AST溶于5.1 mL甲醇（體積分?jǐn)?shù)為80%，pH值為11.0）中，將含有AST的溶液與介質(zhì)在塞式容器中混合，并在40 ℃下于水浴中振搖 16 h，過(guò)量AST用甲醇（體積分?jǐn)?shù)為80%）洗滌。然后將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至1 mol/L乙醇胺（pH值為8）中，于50 ℃過(guò)夜。最后，用 1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH值為8，含有 0.5 mol/L NaCl）徹底沖洗產(chǎn)品3次?？瞻捉橘|(zhì)（指未用AST耦合的環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠6B介質(zhì)）的具體制備方法如下：將0.2 g EAS6B懸浮在50mL蒸餾水中，溶脹后（1 g凍干粉末產(chǎn)生約3.5 mL最終體積的介質(zhì)）用200 mL蒸餾水洗滌介質(zhì)1 h;然后將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至1 mol/L乙醇胺（pH值為8）中，于50 ℃過(guò)夜;最后用1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH值為8，含有0.5 mol/L NaCl）徹底沖洗產(chǎn)品3次。

1.2.2 抗AST單克隆抗體的純化 為了用AST-EAS6B純化抗AST抗體，本試驗(yàn)制備了免疫親和色譜柱，從含抗AST單抗的5 mL小鼠腹水中純化了活性抗AST單抗。將AST-EAS6B介質(zhì)裝入1個(gè)普通的固相萃取柱中，上部、下部裝上篩板。對(duì)固相萃取流出液進(jìn)行收集，并利用紫外分光光度計(jì)（Huxi HD-21-2）進(jìn)行分析。用偶聯(lián)緩沖液洗滌柱子，直到流出液在280 nm處的吸光度為0。然后，用10倍柱體積的純化水沖洗，并用10倍柱體積的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（NaH2PO4/Na2HPO4，pH值為7.0）平衡。用20 mL平衡緩沖液稀釋含抗AST單抗的小鼠腹水（5 mL），以0.3 mL/min的流速裝入柱中。樣品裝入后，用10倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，然后用洗脫緩沖液（0.1 mol/L甘氨酸緩沖液，pH值為2.7）洗脫mAb（單克隆抗體，指AST單抗），直到流出液在280 nm處的吸光度為0，洗脫的抗體立即用Tris堿中和。用G-葡聚糖凝膠純化單克隆抗體時(shí)，將G-葡聚糖凝膠裝入固相萃取柱中，上部、下部裝上篩板，后續(xù)方法與上述用AST-EAS6B純化抗AST抗體的方法相同。為了比較，使用“1.2.1”節(jié)的空白介質(zhì)制備的柱純化5 mL小鼠腹水作為對(duì)照。純化后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，10%丙烯酰胺）分離，用考馬斯亮藍(lán)（CBB）染色，用微量蛋白UV定量?jī)x測(cè)定純化的單克隆抗體濃度[8-9]。

1.2.3 間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)抗AST單克隆抗體 用間接ELISA檢測(cè)時(shí)，將AST-OVA用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH值為9.6）溶解成濃度為1.25 μg/mL，包裹在96孔微量滴定板（美國(guó)康寧公司）上，于4 ℃孵育過(guò)夜;用含0.05%吐溫20的磷酸鹽吐溫緩沖液沖洗3次，再用1%（m/V）脫脂奶粉在37 ℃磷酸鹽緩沖液中封閉1 h，封閉非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)。將純化的單克隆抗體、陰性對(duì)照組（生理鹽水）和空白對(duì)照組（用相同方法純化的無(wú)單克隆抗體的正常小鼠腹水）在磷酸鹽緩沖液中稀釋至1 ∶ 1 000～1 ∶ 50 000，每孔加入100 μL，1式3份。將微孔滴板在37 ℃下孵育60 min，用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌，在每個(gè)孔中加入1 ∶ 5 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG+。將平板在37 ℃下孵育1 h，洗凈，加入TMB基質(zhì)溶液（含0.2 mg/mL TMB，將50 μL 30% H2O2溶解在10 mL 0.1 mol/L檸檬酸鹽-0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中，pH值為 5.2），將平板在室溫下孵育30 min，用50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，使用BioTek ELx800 ELISA閱讀器在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度[10]，試驗(yàn)1式3份，以平均值作為最終值。用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（idcELISA）方法檢測(cè)純化的抗AST單克隆抗體的特異性時(shí)，以50 μL連續(xù)稀釋的AST為競(jìng)爭(zhēng)物，與50 μL最佳稀釋的純化抗AST單克隆抗體一同加入微孔中，1式2份。在陽(yáng)性對(duì)照孔中，抗AST單克隆抗體沒(méi)有添加任何競(jìng)爭(zhēng)物AST，其他步驟與間接ELISA所描述的步驟相同。

2 結(jié)果與分析

在抗AST單克隆抗體的純化步驟中，從加入 5 mL 小鼠腹水開(kāi)始，將純化的mAb冷凍干燥、稱質(zhì)量。結(jié)果表明，用AST-EAS6B柱純化的抗AST單克隆抗體為2.9 mg，用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗AST單克隆抗體為3.5 mg。用磷酸緩沖鹽溶液將2種方法純化的mAb稀釋到1 mg/mL的濃度，用間接ELISA法檢測(cè)抗AST抗體的效價(jià)，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗AST抗體的敏感度。如表1、圖1所示，用AST-EAS6B柱純化的抗AST單克隆抗體的效價(jià)大于25 600，而用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗AST單克隆抗體的效價(jià)約為18 000。由圖2可以看出，用AST-EAS6B柱純化的抗AST單克隆抗體的效價(jià)略高于用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗體效價(jià)。間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA結(jié)果（表2、圖2）顯示，用 AST-EAS6B 柱純化的抗AST單克隆抗體的結(jié)合抑制50%濃度（IC50）為0.005 μg/mL，用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗AST單克隆抗體的IC50為 0.05 μg/mL。間接ELISA、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，陰性對(duì)照的D450 nm顯著低于抗AST單克隆抗體的D450 nm（P<0.05）。最終值采用3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。以上結(jié)果表明，用AST-EAS6B純化的抗AST單克隆抗體比用G-葡聚糖凝膠柱純化的抗AST單克隆抗體對(duì)AST更具有特異性。

3 討論

在筆者之前的研究中，從小鼠腹水中純化抗AST單克隆抗體是用一些非特異性的方法，如蛋白G的不同組合、離子交換和排阻色譜技術(shù)。這些用非特異性方法純化的單克隆抗體對(duì)于現(xiàn)實(shí)的研究和應(yīng)用來(lái)說(shuō)不夠靈敏，而且純化耗時(shí)較長(zhǎng)。當(dāng)有足夠量的抗原被固定時(shí)，能夠提供較強(qiáng)的結(jié)合力，基于固定抗原的親和層析技術(shù)是非常有效的[11]。在本研究中，1 mL ESA6B約耦合1.35 mg AST，并且高的耦合速率確保了AST-EAS6B柱的強(qiáng)結(jié)合能力。當(dāng)用AST與環(huán)氧活化瓊脂糖6B（EAS6B）偶聯(lián)制備的免疫親和柱制備完成后，用該方法從小鼠腹水中純化抗AST單克隆抗體能夠獲得高效價(jià)、高特異性的抗體。純化抗AST單克隆抗體的結(jié)果表明，固定化AST親和色譜可以選擇性地捕獲與AST特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，能夠有效地完成變性抗體的排除和活性抗體的特異性捕獲。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究高靈敏度、高效價(jià)的抗AST單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)，如ELISA檢測(cè)AST的定量檢測(cè)方法的建立。此外，基于其選擇性捕獲與AST結(jié)合的蛋白的能力，固定化AST親和層析可用于鑒定不同組織中的AST靶點(diǎn)[12]。本研究還提供了1種制備具有類似活性基團(tuán)的其他天然化合物的親和層析樹(shù)脂的方法。

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