李昌波 孫杰 肖華毅 胡新春 鄧超英

肺纖維化是一種難治性、高死亡率的肺間質(zhì)性疾病，肺纖維化病因廣泛，主要類型包括已知原因所致肺纖維化、特發(fā)性間質(zhì)性疾病、肺結(jié)節(jié)病、其他類型的肺纖維化等。除已知原因類型肺纖維化外，其他類型的肺纖維化治療前景堪憂，無特效藥物[1-2]。肺纖維化發(fā)展為終末期，導(dǎo)致呼吸衰竭，肺移植是唯一的治療方法。有相關(guān)文獻及課題研究IL-27能有效抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化進程，減輕肺纖維化的程度[3-6]，本課題前期實驗證實IL-27較N-乙酰半胱氨酸(NAC)能更有效抑制肺纖維化的程度，其機制不明；通過對各組小鼠肺組織中相關(guān)因子的檢測，了解IL-27與NAC影響肺組織中相關(guān)因子的表達，推測其二者影響肺纖維化的機制。

資料與方法

一、材料

SPF級雄性C57/BL6小鼠(6～8周齡)80只，體重18～22g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于四川省內(nèi)江市醫(yī)科學(xué)?；A(chǔ)實驗室，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級[7]。注射用博萊霉素粉針劑(bleomycin,BLM)(日本化藥株式會社)，IL-27重組蛋白注射劑(美國Ebioscience公司)，N-乙酰半胱氨酸泡騰片(NAC)(海南贊邦制藥有限公司)，組織研磨機(蘭州輕工業(yè)機械有限公司)，ELSSA試劑盒(武漢華美生物科技有限公司)。

二、實驗方法

1 實驗分組 將80只C57/BL6小鼠隨機分為正常組(A組)、BLM模型組(B組)、BLM+IL-27組(C組)、BLM+NAC組(D組)，每組各20只；給予10%水合氯醛麻醉小鼠后，A組小鼠采用經(jīng)支氣管一次性注入生理鹽水0.05 mL；B、C、D組小鼠氣管內(nèi)注射博萊霉素溶液0.05 mL(5 mg/kg)復(fù)制肺纖維化模型[8]。C組造模后1d開始腹腔皮下注射小鼠IL-27重組蛋白溶液1ug/只/天，連續(xù)注射7天；D組造模前1周開始灌胃NAC溶液3mmol/kg.d，造模后繼續(xù)每天灌胃NAC溶液直至處死[9-10]。

2 實驗動物模型建立及取材 各組小鼠均在造模后第7天、14天、28天分別處死5只小鼠，采取放血法處死小鼠，分別獲取雙肺組織、脾臟，左肺組織用10%福爾馬林溶液固定，24 h后進行石蠟包埋并切片行HE、Masson染色；右肺組織及脾臟置入液氮后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3 右肺組織檢測相關(guān)因子 取各組小鼠右肺部分組織用組織研磨機研磨成糊狀，PBS稀釋，獲取組織上清液，濾過去除雜質(zhì)。ELISA檢測肺組織上清液中不同細胞因子濃度，根據(jù)標準品的濃度及標準品OD值分別建立標準曲線。檢測各組小鼠肺組織上清液中的IFN-γ、TGF-β、IL-6、IL-10、IL-17的因子的濃度[11]。操作步驟按ELISA實驗盒說明進行。

三、統(tǒng)計方法

結(jié) 果

一、各組小鼠肺組織中IFN-γ濃度結(jié)果(見圖1、圖2、表1)。

圖1 IFN-γ濃度的標準曲線圖

圖2 IFN-γ細胞因子濃度柱狀圖(注：“#、##、##”表示同一時間點內(nèi)不同組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；“*”表示同一組不同時間點差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)

表1 各組小鼠肺組織中IFN-γ濃度結(jié)果統(tǒng)計表

注：表中多組比較方差分析數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

由圖1、圖2、表1結(jié)果分析如下：不同時間點:A組各時間點IFN-γ濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B、C、D組不同時間點間IFN-γ濃度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且趨勢一致，即各組均是第7天最高，第14天其次，第28天最低。

同一時間點：B、D組在第14天和第28天兩兩比較IFN-γ濃度差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖2)；其余各組在不同時間點兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)，且表現(xiàn)為同一趨勢，即:C組最高，B組最低。

二、各組不同時間點小鼠肺組織中TGF-β1濃度結(jié)果(見圖3、4，表2)。

圖3 TGF-β1濃度的標準曲線圖

圖4 TGF-β1細胞因子濃度柱狀圖(注：“#、##、##”表示同一時間點內(nèi)不同組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；“*、**”表示同一組不同時間點差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)

表2 各組不同時間點小鼠肺組織中TGF-β1濃度結(jié)果統(tǒng)計表

注：表中多組比較方差分析數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

由圖3、圖4、表1結(jié)果分析如下：不同時間點:A組不同時間點內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B、C、D各組在三個不同時間點數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖4)，且均表現(xiàn)為同一趨勢，即第28天TGF-β1濃度最高，第14天其次，第7天最低(見表2)。

同一時間點:7天、14點、28天不同時間點各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖4)，且表現(xiàn)為同一趨勢，即各時間點TGF-β1的濃度均是B組最高，D組其次，C組再次，A組最低(見圖4)。

三、各組不同時間點小鼠肺組織中IL-6濃度結(jié)果(見圖5、6，表3)

圖5 IL-6濃度的標準曲線圖

圖6 IL-6細胞因子濃度柱狀圖(注：“#、##、##”表示同一時間點內(nèi)不同組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；“*、**”表示同一組不同時間點差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)

表3 各組不同時間點小鼠肺組織IL-6濃度統(tǒng)計表

注：表中多組比較方差分析數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

由圖5、圖6、表3結(jié)果分析如下:不同時間點:A組不同時間點內(nèi)IL-6濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B、C、D各組在三個不同時間點數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖6)，且均表現(xiàn)為同一趨勢，即第14天IL-6濃度最高，第28天其次，第7天最低(見表3)。

同一時間點:7天、14點、28天不同時間點各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖6)，且表現(xiàn)為同一趨勢，即不同時間點均表現(xiàn)為IL-6的濃度均是B組最高，D組其次，C組再次，A組最低(見圖6)。

四、各組不同時間點小鼠肺組織中IL-10濃度結(jié)果(見圖7、8，表4)

圖7 IL-10濃度標準曲線圖

由圖7、圖8、表4結(jié)果分析如下: 不同時間點:A組不同時間點內(nèi)IL-10濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B、C、D各組在三個不同時間點數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖8)，且均表現(xiàn)為同一趨勢，即第7天IL-10濃度最高，第14天其次，第28天最低(見表4)。

同一時間點:7天、14點、28天不同時間點各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖8)，且表現(xiàn)為同一趨勢，即不同時間點均表現(xiàn)為IL-10的濃度均是B組最高，D組其次，C組再次，A組最低(見圖8)。

圖8 IL-10細胞因子濃度柱狀圖(注：“#、##、##”表示同一時間點內(nèi)不同組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；“*、**”表示同一組不同時間點差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)

表4 各組不同時間點小鼠肺組織中IL-10濃度統(tǒng)計表

注：表中多組比較方差分析數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

五、各組不同時間點小鼠肺組織中IL-17濃度結(jié)果(見圖9、10，表5)

圖9 IL-17濃度的標準曲線圖

表5 各組不同時間點小鼠肺組織中IL-17濃度統(tǒng)計表

注：表中多組比較方差分析數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

圖10 IL-17細胞因子濃度柱狀圖(注：“#、##、##”表示同一時間點內(nèi)不同組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；“*、**”表示同一組不同時間點差異具有統(tǒng)計學(xué)意義)。

由圖9、圖10、表5結(jié)果分析如下:不同時間點:A組不同時間點內(nèi)IL-17濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B、C、D各組在三個不同時間點數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖10)，且均表現(xiàn)為同一趨勢，即第28天IL-17濃度最高，第14天其次，第7天最低(見表5)。

同一時間點:7天、14天、28天不同時間點各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖10)，且表現(xiàn)為同一趨勢，即不同時間點均表現(xiàn)為IL-17的濃度均是B組最高，D組其次，C組再次，A組最低(見圖10)。

討 論

IL-27作為新近發(fā)現(xiàn)的白介素，其由活化的單核細胞、單核細胞來源的樹突狀細胞、淋巴細胞、NK細胞等產(chǎn)生。IL-27受體則在T細胞和NK細胞的表達水平最高[12]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)IL-27可以抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化過程。N-乙酰半胱氨酸(NAC)在氧化/抗氧化失衡和氧化應(yīng)激在肺泡上皮細胞的損傷和纖維化中起重要作用。目前已有大量的研究發(fā)現(xiàn)NAC對肺纖維化有抑制作用，作用機制主要是抗氧化、穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)、清除氧自由基、抑制血管生成因子β(TGF-β)等方面抑制肺間質(zhì)中膠原蛋白的合成，從而抑制肺纖維化的形成[13]；NAC目前已被列為肺纖維化藥物治療中弱推薦藥物[14]。本課題前期已證實IL-27與NAC均具有抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化進程的作用，經(jīng)肺組織HE、Masson染色證實IL-27干預(yù)組肺纖維化程度較NAC干預(yù)組輕，IL-27抑制肺纖維化作用更明顯，作用機制不明。本研究通過檢測各組小鼠肺組織中IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17等細胞因子的濃度，推測IL-27與NAC抑制肺纖維化的機制。

有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)再IPF患者血清中IFN-γ較健康患者明顯減低；有相關(guān)小鼠肺纖維化實驗中，發(fā)現(xiàn)肺纖維化模型小鼠肺組織中IFN-γ濃度較正常小鼠肺組織明顯降低。本研究證實博來霉素可以抑制IFN-γ在肺組織中的濃度，誘導(dǎo)肺纖維化的形成,IL-27和NAC可以升高IFN-γ的濃度，減輕小鼠肺纖維化的程度，且IL-27組肺組織IFN-γ濃度高于NAC組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17均能促進肺纖維化的形成。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1、IL-17在第28天最高，第7天最低，表明TGF-β1、IL-17在藥物誘導(dǎo)的肺纖維化晚期表達最高，主要是促進肺間質(zhì)膠原蛋白的形成，在不同時間點濃度表達均是B組>D組>C組，推測各組間差異由IL-27、NAC所致，但IL-27組明顯低于NAC組及肺纖維化模型組。IL-6的濃度在第14天最高，IL-10在第7天最高，但各組濃度表達不同，B組>D組>C組，IL-27組明顯低于NAC組及肺纖維化模型組；IL-6、IL-10是致炎因子，均在肺纖維化的早期階段最高，抑制致炎因子的表達可以有效抑制TGF-β1、IL-17，減少肺組織中膠原蛋白的生成，減輕肺纖維化的程度。

綜上所述，IL-27、NAC均能抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織中TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17的表達，但IL-27組明顯低于NAC組，IL-27抑制肺組織炎癥反應(yīng)明顯強于NAC；同時在博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化進程中，IL-27較NAC能更有效誘導(dǎo)IFN-γ表達，即IL-27組明顯高于NAC組。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-27和NAC干預(yù)的博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化實驗中，IFN-γ濃度明顯高于肺纖維化模型組，TGF-β1、IL-6、IL-10、IL-17的濃度明顯低于肺纖維化模型組，但IL-27較NAC效果更明顯，其機制還需進一步實驗研究。