羅槑 劉勇 羅東霞 徐園紅 朱瑪 黃濤

結(jié)核病是全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。雖然目前已有有效的化療手段及疫苗，結(jié)核病的治愈率可達(dá)到85%～95%，但是由于結(jié)核合并艾滋耐藥率的增加、耐多藥結(jié)核病(multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB)廣泛耐多藥結(jié)核病(extensive drug resistant tuberculosis, XDR-TB)的出現(xiàn)，免疫抑制劑的使用等原因，還是有部分患者復(fù)發(fā)，甚至還有部分患者因?yàn)橹委熓〕蔀閺?fù)難治結(jié)核，成為耐藥結(jié)核的傳播源，成為公共健康的巨大隱患，也加重了社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),因此還需加強(qiáng)抗結(jié)核防控等方面的研究。

人α-防御素主要有存在于中性粒細(xì)胞的HNP1-HNP4(human neutrophil peptide1-4, HNP1-HNP4)及存在于小腸潘氏細(xì)胞DEFA5(Human Defensin 5, DEFA5)和 DEFA6(Human Defensin 6，DEFA6)[1-2]。HNP具有廣譜抗菌活性，其通過(guò)增加微生物細(xì)胞膜通透性來(lái)清除病原微生物[3]，當(dāng)機(jī)體受到病原微生物感染入侵時(shí)，機(jī)體受到病原刺激，引起中性粒細(xì)胞HNP的廣泛表達(dá)，并立即聚集到炎癥部位直接殺死病原體，是機(jī)體先天免疫的重要組成部分。因此，HNP在結(jié)核病感染過(guò)程中也起著重要作用，當(dāng)在機(jī)體受到結(jié)核分枝桿菌的入侵時(shí)，HNP作為先天性免疫的直接效應(yīng)分子，成為抗菌的第一道防線。

人中性粒細(xì)胞肽1-3(human neutrophil peptide1-3, HNP1-3)除 N 端的第 1 個(gè)氨基酸不同，其它氨基酸序列幾乎完全相同，由于差別極小實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不易區(qū)分，通常檢測(cè)HNP1-3總的基因表達(dá)。近年來(lái)已有研究顯示多種炎癥性肺部疾病與HNP有密切聯(lián)系，但結(jié)核病患者中性粒細(xì)胞肽HNP1-3表達(dá)與疾病關(guān)系的研究還較少。因此，我們通過(guò)檢測(cè)結(jié)核病患者及健康對(duì)照組血清HNP1-3濃度及中性粒細(xì)胞HNP1-3的mRNA表達(dá)水平，探索HNP1-3水平與疾病病情及預(yù)后的關(guān)系。

資料與方法

一、主要試劑

人中性粒細(xì)胞防御素HNP1-3、IL-8酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)于武漢華美生物工程公司CUSABIO；人外周血中性粒細(xì)胞分離液購(gòu)于天津?yàn)笊锟萍加邢薰?；RNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司；引物由invitrogen合成；反轉(zhuǎn)錄、熒光定量SYBR Green PCR Master Mix試劑均購(gòu)于羅氏(Roche)公司，運(yùn)用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)。

二、納入病例來(lái)源

肺結(jié)核組入組研究對(duì)象來(lái)源于成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心2016年1月至2018年6月住院患者，按照《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 288-2008)[4]、《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS 288-2017)[5]經(jīng)臨床診斷為初/復(fù)治肺結(jié)核患者。

健康對(duì)照組來(lái)源于通過(guò)公開(kāi)招募入組的健康志愿者，無(wú)重大疾病病史，經(jīng)體檢顯示身體健康，2周內(nèi)未服用過(guò)任何藥物者納入研究。

三、方法

1.肺結(jié)核組患者外周血均為入院首次采集，血液外周血白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)由本院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科完成，檢測(cè)儀器為希森美康血球分析儀XT-2000i。

2.外周血中性粒細(xì)胞的分離：分別采集結(jié)核病組與健康對(duì)照組空腹靜脈血5 mL，EDTA抗凝，運(yùn)用中性粒細(xì)胞分離液以500 g離心25 min，獲得富集的中性粒細(xì)胞。加入1 mL TRIzol，-80度保存細(xì)胞。

3.中性粒細(xì)胞總RNA的提?。喊凑赵噭┖姓f(shuō)明書(shū)，通過(guò)前處理、裂解、抽提、沉淀、洗滌、溶解等步驟，得到中性粒細(xì)胞總RNA。運(yùn)用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及比值。

4.RNA反轉(zhuǎn)錄: RNA 1ul(1ug/ul), random hexamer prmier 2ul，water 10ul,65℃ 10min；Transcript Reverse Transcriptase Reaction Buffer 4ul，Protease RNase Inhibition 0.5ul，Dexoynucleotide Mix 2ul，Transcriptor Reverse Transcriptase 0.5ul，total volume 20ul，25℃10 min,50℃60 min,85s℃5 min，得到cDNA，用DEPC水按一定比例稀釋后使用。

5.實(shí)時(shí)熒光定量(qPCR)：HNP1/3上游引物：5′-ATGAGGACCCTCGCCATCCTTGCT-3′，下游引物：5′-TCAGCAGCAGAATGCCCAGCGTCTTCCC-3′。反應(yīng)體系為：cDNA 4 μl，Primer F 0.4 μl，Primer R 0.4 μl，SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，ddH2O 5.2 μl, total volume 20 μl。上機(jī)檢測(cè)反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 15s，60℃ 15s，35個(gè)循環(huán)。相對(duì)定量采用2-△△Ct法計(jì)算HNP1-3 mRNA在疾病組水平相對(duì)于健康對(duì)照組人倍數(shù)。

6.運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)：每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或者待測(cè)血清樣本，37℃ 2 h；棄去液體，每孔加生物素標(biāo)記抗體100 μl，37℃ 1 h；洗板；每孔加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記親和素工作液100 μl，37℃ 1 h；洗板；依序每孔加底物溶液90 μl，37℃避光顯色15～30 min；依序每孔終止液50 μl；反應(yīng)終止后5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀450nm檢測(cè)吸光度(OD值)。血清HNP1-3濃度計(jì)算運(yùn)用Curve Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、入組研究對(duì)象基本情況

本研究一共入組199例研究對(duì)象，其中肺結(jié)核組113例，健康對(duì)照組86例。病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核63例，病原學(xué)陰性肺結(jié)核50例；初治肺結(jié)核75例，復(fù)治肺結(jié)核38例；重癥肺結(jié)核62例，輕癥肺結(jié)核51例；肺結(jié)核合并糖尿病25例(見(jiàn)表1)。兩組研究對(duì)象年齡、性別比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 入組研究對(duì)象人口學(xué)資料

二、肺結(jié)核患者外周血中HNP1-3水平及中性粒細(xì)胞HNP1-3的mRNA表達(dá)情況

兩組研究對(duì)象外周血清HNP1-3水平有明顯差異，肺結(jié)核組(TB, tuberculosis)HNP1-3平均值為22.6ng/mL(n=113、22.6±14.4 ng/mL)，健康對(duì)照組(Healthy control)平均值為16.1ng/mL(n=86、16.1±5.7 ng/mL)(見(jiàn)圖1A)。肺結(jié)核組與同健康對(duì)照組相比，肺結(jié)核組外周血HNP1-3水平顯著增高(t=4.008、P<0.001)。同時(shí)，兩組外周血中性粒細(xì)胞HNP1-3在mRNA表達(dá)水平上的差異也表現(xiàn)為肺結(jié)核組HNP1-3的mRNA表達(dá)高于健康對(duì)照組，表達(dá)量升高2.17倍，但兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B，n=6、t=2.221、P=0.051)。

圖1A 肺結(jié)核與健康對(duì)照組外周血HNP1-3水平；圖1B 肺結(jié)核與健康對(duì)照組外周血中性粒細(xì)胞HNP1-3mRNA表達(dá)水平

三、肺結(jié)核患者外周血HNP1-3與疾病病情的關(guān)系

由圖2A可見(jiàn)，病原學(xué)陽(yáng)性肺結(jié)核組TB(+)外周血HNP1-3水平(n=63、23.5±14.5 ng/mL)高于病原學(xué)陰性肺結(jié)核組TB(―)外周血HNP1-3水平(n=50、20.0±10.4ng/mL)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.360、P=0.175)。初治肺結(jié)核組(new tuberculosis, NTB)外周血HNP1-3水平(n=75、22.1±13.7 ng/mL)低于復(fù)治肺結(jié)核組(recurrent tuberculosis, RTB)外周血HNP1-3水平(n=38、23.8±15.7ng/mL)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B,t=0.596、P=0.552)。重癥肺結(jié)核組患者外周血HNP1-3水平(n=62、25.2±16.3ng/mL)高于輕癥肺結(jié)核組(n=51、19.5±11.0ng/mL)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2C，t=2.098、P=0.038)。肺結(jié)核合并糖尿病組(TB+DM)患者外周血HNP1-3水平(n=25、28.6±13.9ng/mL)高于未合并糖尿病肺結(jié)核組(TB，n=88、20.9±14.1ng/mL)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2D，t=2.398、P=0.018)。

四、肺結(jié)核患者外周血HNP1-3與IL-8、中性粒細(xì)胞的關(guān)聯(lián)

圖2A 病原學(xué)陽(yáng)性組與病原學(xué)陰性組外周血HNP1-3水平；圖2B 初治組與復(fù)治組外周血HNP1-3水平；圖2C 輕癥組與重癥組外周血HNP1-3水平；圖2D 肺結(jié)核與肺結(jié)核合并糖尿病組外周血HNP1-3水平

通過(guò)Pearson相關(guān)分析，肺結(jié)核患者外周血HNP1-3水平與炎癥指標(biāo)IL-8呈正相關(guān)(r=0.454、P=0.002)、與中性粒細(xì)胞比例呈相關(guān)(r=0.422、P=0.045)(見(jiàn)表2)。

表2 肺結(jié)核患者外周血HNP1-3、IL-8、中性粒細(xì)胞比例相關(guān)性

注：*P<0.05;**P<0.01

討 論

根據(jù)WHO最新2018全球結(jié)核病報(bào)告顯示，雖然結(jié)核病的防控取得了較好的成效，我國(guó)仍是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，而在結(jié)核病的檢測(cè)和治療上還持續(xù)存在很大的差距[6]。結(jié)核病的免疫反應(yīng)是由細(xì)胞免疫介導(dǎo)，因此基于HNP的天然防御和免疫調(diào)節(jié)功能，近年來(lái)研究認(rèn)為HNP對(duì)結(jié)核病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸有重要影響。作為機(jī)體抵抗病原感染的第一道防線，來(lái)源于中性粒細(xì)胞的HNP1-3在機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌時(shí)的免疫反應(yīng)中也起到重要作用。

近年來(lái)研究顯示HNP1-3具有多種生物學(xué)作用：(1)具有廣譜抗菌活性，可有效的殺傷病毒[7-8]、真菌[9]、細(xì)菌[10-11]等多種微生物；(2)有抑制腫瘤細(xì)胞作用[12]；(3)免疫調(diào)節(jié)作用[13]，還與老年人群對(duì)感染性疾病的易感性相關(guān)[14]。迄今，也有多項(xiàng)研究證實(shí)HNP1-3對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抑制作用[15]：Miyakawa Y 等研究證實(shí)HNP1-3可抑制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)[16]；在結(jié)核分枝桿菌毒株感染小鼠模型中，HNP1能顯著地清除感染小鼠肺、肝臟及脾臟中的病原菌[17]；在活動(dòng)性肺結(jié)核患者的血漿及支氣管肺泡灌洗中也報(bào)道了HNP1-3的增加[18]。

HNP1-3在成熟中性粒細(xì)胞中未被誘導(dǎo)的情況下是處于低轉(zhuǎn)錄水平[19]，因此在健康人群的含量很低。當(dāng)中性粒細(xì)胞活化后，會(huì)迅速釋放HNP，參與宿主防御和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[20-21]。我們的研究顯示，在分枝桿菌感染狀態(tài)下，結(jié)核病患者外周血中性粒細(xì)胞HNP1-3的 mRNA的上調(diào)、外周血清HNP1-3水平的增加，提示分枝桿菌感染引起中性粒細(xì)胞活化促進(jìn)HNP的產(chǎn)生，從而有助于分枝桿菌的清除。同時(shí)，為了進(jìn)一步探索HNP1-3與疾病病情與預(yù)后的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者重癥組外周血HNP1-3顯著高于輕癥組，推測(cè)過(guò)高HNP1-3水平與病情嚴(yán)重程度有關(guān)；而糖尿病是已知與結(jié)核病預(yù)后如治療失敗[22]、復(fù)發(fā)[23]甚至死亡[24]的危險(xiǎn)因素之一，所以我們還比較了是否合并糖尿病的兩組肺結(jié)核患者的血清HNP1-3水平，結(jié)果顯示結(jié)核病合并糖尿病患者外周血HNP1-3水平顯著增高，也提示HNP1-3與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后有關(guān)聯(lián)。由于HNP還參與炎癥、抗原免疫遞呈等免疫調(diào)控過(guò)程，IL-8 是很強(qiáng)的中性粒細(xì)胞趨化因子[25]，且在呼吸道上皮細(xì)胞由HNP1-3介導(dǎo)釋放，因此我們分析了結(jié)核病患者外周血HNP1-3與IL-8及中性粒細(xì)胞比例的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)HNP1-3與兩者之間均呈正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明了升高的HNP1-3在執(zhí)行分枝桿菌清除功能的同時(shí)，可能通過(guò)促進(jìn)IL-8募集更多中性粒細(xì)胞形成炎癥不斷累積的過(guò)程，從而與病情加重有關(guān)。有研究報(bào)道低水平的HNP1-3與耐多藥結(jié)核病(multi drug resistance tuberculosis, MDR-TB)密切相關(guān)[26]，提示HNP1-3水平在疾病過(guò)程中的兩面性：增高雖有利于分枝桿菌的清除但也有可能通過(guò)促進(jìn)炎癥加重來(lái)影響疾病進(jìn)展及預(yù)后。Kumar N等[27]報(bào)道了肺結(jié)核患者HNP1-3與有無(wú)空洞、雙肺或單側(cè)病灶、病原涂片陽(yáng)性級(jí)別等疾病嚴(yán)重程度和病原負(fù)擔(dān)等指標(biāo)無(wú)直接關(guān)聯(lián)，這可能是由于研究的納入標(biāo)準(zhǔn)、地區(qū)、以及研究對(duì)象處于病情、病程階段不同都有一定關(guān)系，這需要我們?cè)诮窈蟮墓ぷ髟龠M(jìn)一步深入探索。

總之，本研究報(bào)道了相對(duì)于健康對(duì)照人群，分枝桿菌感染的狀態(tài)可誘導(dǎo)防御素HNP1-3的mRNA表達(dá)上調(diào)和外周血蛋白水平增加，且與疾病病情、預(yù)后及炎癥指標(biāo)呈正相關(guān)，提示HNP1-3可作為疾病病情及預(yù)后判斷的輔助指標(biāo)，但還需要在進(jìn)一步的工作中結(jié)合不同病程轉(zhuǎn)歸的動(dòng)態(tài)觀察再深入探索。同時(shí)，由于防御素廣譜的抗菌、抗病毒活性，加之其特殊的作用機(jī)理因此不容易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性，本研究也為使用防御素應(yīng)用于臨床治療提供了新思路。