牛海軍，孫旭群，李曉亮，李光輝，路大勇，楊小梅，李玉梅

(1.安徽九方藥物研究院有限公司 研發(fā)部，安徽 合肥 230088；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥劑科，安徽 合肥 230022；3.安徽九方制藥有限公司 研發(fā)部，安徽 亳州 236800)

葛根通絡(luò)膠囊是從豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根中提取純化并制劑成型，為葛根總黃酮單體植物藥，其有效成分總黃酮含量達(dá)到80%以上，遠(yuǎn)高于國內(nèi)外其他植物黃酮類制劑，其具有活血化瘀之功效，用于缺血性中風(fēng)中經(jīng)絡(luò)恢復(fù)期瘀血痹阻脈絡(luò)證，癥見半身不遂、口舌歪斜、偏身麻木、語言不利、頭暈?zāi)垦?、頸項(xiàng)強(qiáng)痛等，動(dòng)脈粥樣硬化性血栓性腦梗塞和腔隙性腦梗塞見上述證候者[1-2]。本公司多年來致力提高本產(chǎn)品質(zhì)量控制，采用高效液相色譜法等不同分析手段，對(duì)本品黃酮類成分進(jìn)行測(cè)定作為質(zhì)量控制手段，并建立了其指紋圖譜的測(cè)定方法[3-7]。以往常利用單品對(duì)照外標(biāo)法測(cè)定各個(gè)有效成分含量，用到的對(duì)照品較多以致成本較高、工序復(fù)雜，限制了此法在企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。一測(cè)多評(píng)法(QAMS)[8-18]可在對(duì)照品較少的情況下對(duì)中藥及其制劑進(jìn)行快速、低成本質(zhì)量控制，所以本研究采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定葛酮通絡(luò)膠囊中5種成分含量，進(jìn)一步提升質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試劑

島津LC-10AT液相色譜儀，包括LC-10AT色譜泵、SPD-M10Avp DAD檢測(cè)器、SIL-10A自動(dòng)進(jìn)樣器、Lcsolution色譜工作站。甲醇和乙腈均為色譜純，美國天地公司；其他試劑均為分析純。3＇-羥基葛根素對(duì)照品：成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：15052309；葛根素對(duì)照品：中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：752-200108；3＇-甲氧基葛根素對(duì)照品：上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：P25D6F8070；葛根素芹菜糖苷對(duì)照品：上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：P09J7F8770；大豆苷對(duì)照品：成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：15031507。葛酮通絡(luò)膠囊：安徽九方制藥有限公司，批號(hào)：180401、180402、180602、180702、180801、180802、180901、180902、181101、181201。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相為甲醇-乙腈(70∶30)和0.05%磷酸溶液二元梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長250 nm，色譜柱為ODS-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，所有組分在50 min內(nèi)洗脫完全。見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 混合對(duì)照品溶液制備

分別精密稱取3＇-羥基葛根素對(duì)照品、葛根素對(duì)照品、3＇-甲氧基葛根素對(duì)照品、葛根素芹菜糖苷對(duì)照品和大豆苷對(duì)照品適量，用甲醇稀釋成1 mL含葛根素100μg、3＇-羥基葛根素對(duì)照品10 μg、3＇-甲氧基葛根素對(duì)照品10 μg、葛根素芹菜糖苷對(duì)照品10 μg和大豆苷對(duì)照品10 μg的混合溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取葛酮通絡(luò)膠囊內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加70%甲醇適量，超聲處理(功率200 W，頻率40 kHz)20 min，放冷，加70%甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取對(duì)照品濃配液，用甲醇稀釋成一系列對(duì)照品溶液。按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄5種成分的峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，分別得到5種成分的回歸方程和線性范圍。見表2。

表2 5種成分的回歸方程及線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

以葛酮通絡(luò)膠囊(批號(hào)：180401)為供試品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備1份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄5個(gè)成分的峰面積。結(jié)果峰面積的RSD值分別為0.21%、0.33%、0.25%、0.11%、0.28%(n=6)，試驗(yàn)結(jié)果表明本方法精密度較好。

圖1混合對(duì)照品色譜

峰1：3＇-羥基葛根素峰；峰2：葛根素峰；峰3：3＇-甲氧基葛根素峰；峰4：葛根素芹菜糖苷；峰5：大豆苷峰

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

以葛酮通絡(luò)膠囊(批號(hào)：180401)為供試品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備1份供試品溶液，分別在室溫放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，測(cè)定其峰面積，5種成分24 h內(nèi)峰面積的RSD值分別為0.18%、0.32%、0.79%、0.81%、0.37%(n=6)，試驗(yàn)結(jié)果表明本法制備的樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

以葛酮通絡(luò)膠囊(批號(hào)：180401)為供試品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，5種成分峰面積的RSD值分別為0.57%、0.92%、0.76%、1.02%、0.56%(n=6)，試驗(yàn)結(jié)果表明本法重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批樣品適量，分別加入一定量的5種成分對(duì)照品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率及RSD值。結(jié)果5種成分的回收率依次為98.1%、99.8%、97.7%、100.3%、98.5%，RSD值分別為1.23%、0.81%、1.55%、1.07%、0.93%，試驗(yàn)結(jié)果表明本法準(zhǔn)確度較好。

2.9 相對(duì)校正因子(RCF)計(jì)算

本研究以葛根素為內(nèi)標(biāo)物，按照一測(cè)多評(píng)法公式計(jì)算，結(jié)合混合對(duì)照品溶液測(cè)得的峰面積，計(jì)算葛根素對(duì)另外4種成分的RCF值。結(jié)果3＇-羥基葛根素、3＇-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷和大豆苷的RCF值分別為0.993、1.054、0.965、1.025。

2.10RCF耐用性考察

本研究中考察了不同儀器設(shè)備和不同的色譜柱(250 L×4.6 mm，5 μm)對(duì)RCF測(cè)得結(jié)果的影響，結(jié)果見表3，表明本次考察的儀器和色譜柱耐用性較好。

表3 不同儀器和色譜柱測(cè)得的RCF

2.11樣品的含量測(cè)定

分別取葛酮通絡(luò)膠囊10批次樣品適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，對(duì)比一測(cè)多評(píng)法(QAMS)與外標(biāo)法曲線法(ESM)測(cè)得的5種成分的含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明2種方法測(cè)定的3＇-羥基葛根素、葛根素、3＇-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷和大豆苷的含量無明顯差異。

表4 不同儀器和色譜柱測(cè)得的RCF (mg/粒)

3 討論

葛酮通絡(luò)膠囊是由葛根總黃酮與適量輔料經(jīng)加工制成的膠囊。葛根總黃酮從植物葛根中經(jīng)提取分離、純化得到的黃酮類成分，是目前唯一的葛根總黃酮單體植物藥，其有效成分總黃酮含量達(dá)到72%以上。目前該標(biāo)準(zhǔn)為新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第79冊(cè)，其含量測(cè)定中僅以葛根素單一成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)，存在一定的局限性，本研究的建立能更好地控制產(chǎn)品的質(zhì)量。

研究中采用DAD檢測(cè)器對(duì)供試品溶液在200～400 nm進(jìn)行掃描生成三維色譜圖，對(duì)不同波長下的色譜圖進(jìn)行分析，結(jié)果在主成分葛根素的最大吸收波長250 nm下，能夠檢出其余4種成分峰，且各峰響應(yīng)值較大，因此選定 250 nm為測(cè)定波長。

本研究以葛根素為內(nèi)標(biāo)物，使用外標(biāo)曲線法與一測(cè)多評(píng)法測(cè)定4種成分的含量無明顯差異，本法操作簡便，穩(wěn)定性較好，檢測(cè)成本較低。由于葛根素對(duì)照品價(jià)廉易得，性質(zhì)穩(wěn)定，所以選擇葛根素為內(nèi)標(biāo)物。

本研究中建立的一測(cè)多評(píng)法穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密度均較好，且采用了多批次樣品的驗(yàn)證，可用于評(píng)價(jià)葛根通絡(luò)膠囊質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。