凌成利，雷 昌，劉洪兵，張濟(jì)輝，向愛香，林宗善，朱 瑾，黃 丹

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑即中藥標(biāo)準(zhǔn)煎液，是以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，參考并結(jié)合現(xiàn)代提取方法，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備而成的單味中藥的水煎劑[1]，可用于指導(dǎo)臨床標(biāo)準(zhǔn)化用藥，保證用藥的準(zhǔn)確性和安全性[2]。隨著中藥現(xiàn)代化步伐的加快，中藥行業(yè)涌現(xiàn)出多種中藥用藥形式，如中藥配方顆粒。中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑是標(biāo)準(zhǔn)化以水為溶媒的包括配方顆粒在內(nèi)的新型用藥形式，較大程度上解決了中藥配方顆粒等新型用藥形式與臨床中藥湯劑間存在質(zhì)量和療效差異的問題[3-4]。在《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》(征求意見稿)中明確要求有關(guān)中藥配方顆粒的所有項(xiàng)目均應(yīng)與其標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行對(duì)比研究[5]，故在中藥配方顆粒研究前需進(jìn)行其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究。

天麻(GastrodiaelataBlume)為蘭科植物天麻的干燥塊莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，《開寶本草》亦有記載。天麻具有熄風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，常用于頭痛、肢體麻木等癥狀的治療[6-7]。天麻為臨床常用中藥，目前關(guān)于其化學(xué)成分的研究頗多，其主要含有天麻素等酚類化合物、天麻多糖、對(duì)羥基苯甲醇等成分[8]。有文獻(xiàn)[9]表明，鮮天麻的主要化學(xué)成分為天麻素與對(duì)羥基苯甲醇，且對(duì)羥基苯甲醇含量比天麻素高。目前研究天麻飲片指標(biāo)成分含量測(cè)定及指紋圖譜的文獻(xiàn)較多，關(guān)于天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指標(biāo)成分含量及指紋圖譜的文獻(xiàn)較少。

本文以天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑為例，闡述天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備和質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。參照《中藥配方顆粒管理辦法》(征求意見稿)和《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定要求》(征求意見稿)，收集數(shù)個(gè)不同產(chǎn)地的有代表性的天麻藥材，通過制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑并建立檢測(cè)方法，測(cè)定天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑中天麻素及對(duì)羥基苯甲醇的含量并計(jì)算其出膏率和轉(zhuǎn)移率。同時(shí)，對(duì)15批天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行HPLC指紋圖譜的研究，為天麻配方顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與試劑

電子天平(AL204，梅特勒-托利多上海有限公司)；水循環(huán)真空泵(SHB-Ⅲ，鄭州紫拓儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph Hei-VAP，上海本昂科學(xué)儀器有限公司)；Aigent-1260高效液相色譜儀(安捷倫儀器設(shè)備有限公司)；恒溫循環(huán)鼓風(fēng)干燥箱(WGL-230B，天津市泰斯特儀器有限公司)。

天麻素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110807-201809，純度：98%)；對(duì)羥基苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：111970-201702，純度：98%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院。水為超純水，乙腈、甲醇為色譜級(jí)，其余為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

收集不同產(chǎn)地15批天麻藥材，分別購(gòu)自云南、東北、湖南、貴州、湖北等地，包括主要產(chǎn)區(qū)和道地產(chǎn)區(qū)，參照《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)天麻各項(xiàng)指標(biāo)檢驗(yàn)要求，均合格。具體信息見表1。

表1 天麻藥材信息

2 方法

2.1 供試品和標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備

2.1.1 天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備 稱取天麻藥材20.0 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入9倍量水，充分潤(rùn)濕，浸泡30 min。待浸泡完全后，打開電熱套，將圓底燒瓶置于電熱套上，加熱回流提取，保持沸騰30 min，180目篩網(wǎng)趁熱過濾，殘?jiān)偌尤?倍量水，回流20 min，180目篩網(wǎng)濾過，合并濾液，并減壓濃縮至100 mL，即得天麻藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.1.2 天麻供試品溶液制備 將上述天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑搖勻，取1 mL標(biāo)準(zhǔn)湯劑置于2 mL離心管中，3 000 rpm離心5 min，得上清液，即為供試品溶液。

2.1.3 天麻標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 稱取天麻素和對(duì)羥基苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，加乙腈-水(3∶97)混合溶液，制成天麻素質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1，對(duì)羥基苯甲醇質(zhì)量濃度為25 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，搖勻，即得。

2.2 出膏率

分別量取“2.1”項(xiàng)下溶液適量，體積為V，攪拌均勻，置于75 mL圓底蒸發(fā)皿(重量為m1)中，恒溫水浴加熱蒸干，于105 ℃干燥3 h，冷卻后即得，并精密稱量，記錄其重量(m2)，藥材重量為M，根據(jù)以下公式計(jì)算天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率，出膏率(ER%)=(m2-m1)×100/(M×V)×100%。

2.3 轉(zhuǎn)移率

分別將“2.2”和“2.5.1”項(xiàng)下的天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量代入以下公式中，計(jì)算天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑中天麻素與對(duì)羥基苯甲醇的轉(zhuǎn)移率，即轉(zhuǎn)移率(%)=標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)成分的含量/藥材中指標(biāo)成分的含量×100%。

2.4 HPLC色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，UV檢測(cè)器；采用乙腈與0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，洗脫程序?yàn)?～11 min，3%～5%A；11～18 min，5%A；18～31 min，5%～14%A；31～38 min，14%A；38～48 min，14%～20%A；48～55 min，20%～24%A；55～75 min，24%～80%A；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.5 HPLC方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系將天麻素標(biāo)準(zhǔn)品溶液與對(duì)羥基苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別用甲醇稀釋2、4、8、16、32、64倍，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，以各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)，波長(zhǎng)220 nm下峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。天麻素線性方程為Y=327.85X-241.60，r=0.999 9；對(duì)羥基苯甲醇線性方程為Y=219.07X-229.18，r=0.999 8。

2.5.2 精密度考察取同一批天麻供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下HPLC色譜條件進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)定其峰面積并記錄，計(jì)算天麻素和對(duì)羥基苯甲醇峰面積RSD，均小于2.0%，滿足含量測(cè)定要求，故精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性考察 取同一批天麻藥材樣品，按供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，按照HPLC色譜方法測(cè)定，進(jìn)樣量為10μL，天麻素和對(duì)羥基苯甲醇峰面積RSD均小于1.0%，說明該實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑的供試品溶液，放置0、1、2、4、6、12、24 h后按照HPLC色譜條件進(jìn)樣10 μL，測(cè)定其峰面積變化并記錄，24 h內(nèi)天麻素和對(duì)羥基苯甲醇峰面積RSD均小于1.5%，符合測(cè)量要求，說明在24 h內(nèi)天麻素與對(duì)羥基苯甲醇供試品性質(zhì)穩(wěn)定。

2.5.5 回收率考察平行量取同一批天麻供試品溶液6份，分別向其中加入天麻素、對(duì)羥基苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)品0.05 mg、0.025 mg，混勻，按照HPLC色譜條件進(jìn)樣10 μL，記錄天麻素和對(duì)羥基苯甲醇峰面積，并計(jì)算回收率，在90%～110%之間，說明此方法符合測(cè)定要求。

2.5.6 天麻素與對(duì)羥基苯甲醇含量測(cè)定 分別精密吸取15批天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液10μL，采用HPLC色譜儀測(cè)定并分析，記錄波長(zhǎng)在200 nm下天麻素和對(duì)羥基苯甲醇的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其相對(duì)含量。

3 結(jié)果

3.1 天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率的計(jì)算

按照“2.1”和“2.2”項(xiàng)下方法，制備天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并計(jì)算天麻15批藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率(見表2)。由表2可知，天麻15批藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率范圍為10.5%～21.15%，平均值為16.47%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.62%。

3.2 天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各成分轉(zhuǎn)移率及含量測(cè)定

3.2.1 天麻藥材含量測(cè)定按照“2.4”項(xiàng)下方法，測(cè)定15批天麻各成分含量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，15批天麻藥材各成分含量均符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》要求，且云南5批天麻飲片含量相對(duì)較高。

3.2.2 天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑各成分含量測(cè)定及轉(zhuǎn)移率計(jì)算按照“2.4”項(xiàng)下方法，測(cè)定15批天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各成分含量，并計(jì)算其轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，天麻素含量范圍為4.85 ～20.12 mg·g-1，均值為13.56 mg·g-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.667 mg·g-1，其轉(zhuǎn)移率范圍為22.67%～69.25%，均值為50.66%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為12.31%。對(duì)羥基苯甲醇含量范圍為4.28 ～14.38 mg·g-1，均值為7.91 mg·g-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.22 mg·g-1，其轉(zhuǎn)移率范圍為40.90%～89.48%，均值為60.62%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為15.21%。

表3 15批天麻藥材各成分含量

表4 15批天麻飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的各成分含量及轉(zhuǎn)移率

3.3 天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜

3.3.1 標(biāo)識(shí)共有色譜峰 按照“2.4”項(xiàng)下方法，分別測(cè)定15批天麻藥材標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜，并標(biāo)識(shí)，記錄其色譜信息，生成對(duì)照指紋圖譜，見圖1。

3.3.2 方法學(xué)考察 精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性結(jié)果顯示，所有共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.0%，相對(duì)峰面積RSD<2.0%，且指紋圖譜相似度均大于0.99，說明此指紋圖譜測(cè)定方法中精密度滿足要求，重復(fù)性良好，供試品在12 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，滿足穩(wěn)定性要求，可用于天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的測(cè)定。

3.3.3 15批天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜 按照“2.4”項(xiàng)下方法，進(jìn)行15批天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的測(cè)定并進(jìn)行合并對(duì)照，結(jié)果見圖2。

圖1天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有峰

圖215批天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜

通過對(duì)比15批天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜，共發(fā)現(xiàn)7個(gè)共有峰，在對(duì)照指紋圖譜過程中，以天麻素和對(duì)羥基苯甲醇色譜峰的保留時(shí)間和峰面積參比，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，結(jié)果見表5。通過中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件分析并計(jì)算，15批天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑相似度均符合指紋圖譜要求。

表5 15批天麻共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積

4討論

本實(shí)驗(yàn)選取5個(gè)產(chǎn)地的15批天麻藥材，采用標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑，同時(shí)考察了天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量，主要從以下3個(gè)方面進(jìn)行質(zhì)量控制：①藥材基源的控制。選擇具有代表性的道地藥材，共15批，并進(jìn)行鑒定，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015版中各項(xiàng)指標(biāo)要求。②標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備過程控制。制備過程統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化，如根據(jù)不同部位確定加水量等。所制得的15批天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為(16.47±3.62)%，收率相對(duì)穩(wěn)定，具有一定的代表性。天麻素轉(zhuǎn)移率平均值為(50.69±12.31)%，對(duì)羥基苯甲醇轉(zhuǎn)移率平均值為(60.62±15.21)%，不同產(chǎn)地差異較大，以云南產(chǎn)地相對(duì)較高。③標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制。采用中藥指紋圖譜與指標(biāo)性成分含量測(cè)定相結(jié)合，既從整體上標(biāo)識(shí)了標(biāo)準(zhǔn)湯劑的輪廓，又從成分定量上進(jìn)行指認(rèn)，明確標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主要成分及在制備過程成分中的相對(duì)變化，進(jìn)一步說明了標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為天麻及其他標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制研究提供了參考。

出膏率和轉(zhuǎn)移率是考察制備工藝穩(wěn)定或均一性的主要指標(biāo)，而不同批次間的標(biāo)準(zhǔn)湯劑羿同是通過指紋圖譜和含量測(cè)定來體現(xiàn)，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量控制來說，優(yōu)先考慮藥典中藥材或飲片所規(guī)定的指標(biāo)成分。代云桃等[10]研究表明：若藥典中規(guī)定的指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移率低或提取效率低，基本提取不出來，而標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)性成分含量極低，不適合作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，那么研究者需要在其他主要成分中重新選擇，且要考慮指標(biāo)性成分的水溶性，較脂溶性成分而言，水溶性成分提取效率更高，轉(zhuǎn)移率更高。

天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備工藝是參照《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定要求》(征求意見稿)[4]的要求，根據(jù)不同藥用部位規(guī)定了相應(yīng)的工藝參數(shù)，規(guī)范化建立天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝，從而對(duì)配方顆粒的相關(guān)研究有標(biāo)準(zhǔn)化指導(dǎo)作用，從根本上保證了質(zhì)量的均一性和可控性，為配方顆粒的研究提供了參考標(biāo)準(zhǔn)。

天麻藥材中的主要成分為天麻素和天麻多糖，在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中，其他成分相對(duì)含量偏低，色譜峰小，且2015版《中華人民共和國(guó)藥典》中以天麻素和對(duì)羥基苯甲醇為主要指標(biāo)性成分來判斷藥材合格與否[11]，本實(shí)驗(yàn)對(duì)天麻素和對(duì)羥基苯甲醇含量進(jìn)行了標(biāo)定，其他共有峰在指紋圖譜中進(jìn)行定性標(biāo)識(shí)。

指紋圖譜是中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑主要成分的有效控制手段，通過指紋圖譜信息可反映標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備過程中成分的變化或轉(zhuǎn)移情況，本文對(duì)制備的15批天麻標(biāo)準(zhǔn)湯劑的7個(gè)共有峰進(jìn)行相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的計(jì)算，其中天麻素和對(duì)羥基苯甲醇相對(duì)保留時(shí)間和峰面積在批次間差異不大，峰面積百分比低于10%的共有峰的變化范圍暫不要求。但峰面積百分比低于20%而高于10%的共有峰，其保留時(shí)間和峰面積在批次間差異相對(duì)較大，其可能原因有待進(jìn)一步深入考察。