王秀文，裴曉麗，閆潤(rùn)紅，盧乃木，寧 娜

(山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619)

五子衍宗丸補(bǔ)腎益精，主要用于腎虛精虧所致的陽(yáng)痿不育、遺精早泄、腰痛、尿后余瀝[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，加味五子衍宗方及其有效成分總多糖(TP)能顯著提高輕度認(rèn)知障礙患者(MCI)的記憶能力，明顯改善由東莨菪堿引起的小鼠記憶獲得障礙[2]。但是作者發(fā)現(xiàn)，目前對(duì)五子衍宗丸多糖的研究較少，對(duì)其提取方法的研究則更少。賀福元等[3]采用超聲提取法對(duì)不同批號(hào)的五子衍宗顆粒的多糖含量進(jìn)行了測(cè)定，其平均含量?jī)H為12.64%，而本研究報(bào)道的生殖營(yíng)養(yǎng)方是在五子衍宗方的基礎(chǔ)上添加了少量?；撬?、食用氧化鋅和松花粉等添加劑，并制成膠囊[4]。本實(shí)驗(yàn)采用4種不同的回流提取方法(水提法、醇提法、堿水提取法、堿醇提取法)制備生殖營(yíng)養(yǎng)方多糖粗品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定生殖營(yíng)養(yǎng)方多糖的含量。通過(guò)比較多糖的提取率，為尋找較為適宜的生殖營(yíng)養(yǎng)方多糖的提取工藝提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材及主要試劑

枸杞子、菟絲子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)、鹽車前子，這五味藥均由北京同仁堂購(gòu)買，并由山西中醫(yī)藥大學(xué)裴香萍副教授鑒定為正品；葡萄糖(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉(分析純，濟(jì)寧市旭力化工有限公司)；氯仿(分析純，北京市亞南偉業(yè)氣體有限公司)；正丁醇(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；95%乙醇(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；苯酚(分析純，濟(jì)南華凱樹脂有限公司)；濃硫酸(分析純，青島寶澤化工有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-1600紫外可見分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)；2NHW-Ⅱ型電熱套(鞏義市予體儀器有限公司)；HH-6型水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；GZX-9246MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；LC-4012低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；CR雙表雙關(guān)SHB-D循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 葡萄糖對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品0.2 g，加蒸餾水溶解并稀釋至1 000 mL，精密吸取25 mL稀釋至50 mL，配制成濃度為1.140×10-4mg·L-1的對(duì)照品溶液，放入冰箱中備用。

2.2 多糖供試液的制備

精密稱取多糖約0.2 g，加入適量蒸餾水溶解，定量轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，精密移取0.4 mL此溶液于10 mL量瓶中，加蒸餾水定容，即得。

2.3 生殖營(yíng)養(yǎng)方多糖的提取方法

2.3.1 水提法 生殖營(yíng)養(yǎng)方膠囊的制備方法在以前的研究中已有詳述[4]，這里就不再贅述。取7粒生殖營(yíng)養(yǎng)方膠囊，拆分，取生殖營(yíng)養(yǎng)方膠囊內(nèi)容物約2.0 g，精密稱定，加入80倍的自來(lái)水，回流1 h。將提取液濃縮至65 mL，并冷卻至室溫，倒入分液漏斗中，用Sevag法(氯仿∶正丁醇=4∶1)去除蛋白，測(cè)得剩余提取液為51 mL，在攪拌的情況下加入3倍量的95%乙醇進(jìn)行醇沉，醇沉?xí)r間為24 h，抽濾，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌，并在室溫下干燥，稱重，置于干燥器中，備用。

2.3.2 醇提法 取7粒生殖營(yíng)養(yǎng)方膠囊，拆分，取生殖營(yíng)養(yǎng)方膠囊內(nèi)容物約2.0 g，精密稱定，加入80倍量30%的乙醇，回流1 h。從“將提取液濃縮至65 mL”開始，按照“2.4.1”項(xiàng)下方法制得生殖營(yíng)養(yǎng)方多糖。

2.3.3 堿水提取法 取7粒生殖營(yíng)養(yǎng)方膠囊，拆分，取生殖營(yíng)養(yǎng)方膠囊內(nèi)容物2.0 g，精密稱定，加入80倍量pH=10～11的自來(lái)水，回流1 h，從“將提取液濃縮至65 mL”開始，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法制得生殖營(yíng)養(yǎng)方多糖。

2.3.4 堿醇提取法 取7粒生殖營(yíng)養(yǎng)方膠囊，拆分，取生殖營(yíng)養(yǎng)方膠囊內(nèi)容物約2.0 g，精密稱定，加入80倍量pH=10～11的30%乙醇，回流1 h，從“將提取液濃縮至65 mL”開始，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法制得生殖營(yíng)養(yǎng)方多糖。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

分別精密量取蒸餾水、濃度為1.140×10-4g·mL-1的葡萄糖對(duì)照品溶液和“2.2”項(xiàng)下制備的堿水提取的多糖溶液1.0 mL，分別置于10 mL的量瓶中，并加入5%的苯酚1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，在冷水中放置10 min，用蒸餾水定容至10 mL，放置于冷水中顯色15 min。在波長(zhǎng)400～800 nm之間，對(duì)這三種溶液進(jìn)行掃描。結(jié)果供試品與標(biāo)準(zhǔn)品溶液在490 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，而空白溶液在此波長(zhǎng)無(wú)干擾，故選用測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm。

3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密移取“2.1”項(xiàng)下配制的1.14×10-4mg·L-1葡萄糖對(duì)照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mL于10 mL量瓶中，分別加入蒸餾水至2 mL，分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，置于冷水中放置10 min，加蒸餾水定容，置于冷水中顯色15 min。在490 nm的波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)試液的吸光度。以葡萄糖對(duì)照品溶液濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.0218x+0.0821(r=0.999 7)，結(jié)果表明，葡萄糖在4.56～18.24 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 方法學(xué)考察

3.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取1.14×10-4mol·L-1葡萄糖對(duì)照品溶液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，按“3.1”項(xiàng)下顯色方法顯色，測(cè)定6次，平均吸光度為0.578 2，吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.56%，表明儀器具有良好的精密度。

3.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取堿水提取、按“2.2”項(xiàng)下方法所配制的多糖供試液1.0 mL，按“3.1”項(xiàng)下顯色方法顯色，分別于0、0.5、1、1.5、2.5、4、6、8 h測(cè)定吸光度(A)，考察其穩(wěn)定性，吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.86%，結(jié)果表明，在8 h內(nèi)，樣品具有良好的穩(wěn)定性。

3.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備多糖，精密吸取堿水提取、按照“2.2”項(xiàng)下方法所配制的多糖供試液1.0 mL，共6份，分別置于10 mL量瓶中，按“3.1”項(xiàng)下方法測(cè)量其吸光度(A)，吸光度的平均值為0.497 8，其RSD為1.9%。結(jié)果表明，所用方法具有良好的重復(fù)性。

3.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 取生殖營(yíng)養(yǎng)方膠囊內(nèi)容物1.0 g，精密稱定，精密加入1.14×10-4g·L-1葡萄糖對(duì)照品溶液0.4 mL，按照“2.3.3”項(xiàng)下方法制備多糖6份，精密吸取按照“2.2”項(xiàng)下方法所配制的多糖供試液1.0 mL，共6份，并按“3.1”項(xiàng)下測(cè)定方法測(cè)定吸光度(A)，平均回收率為99.33%，RSD為1.9%。

3.4 樣品測(cè)定

精密吸取按“2.2”項(xiàng)下方法制備的供試液1.0 mL，按照“3.1”項(xiàng)下方法顯色并測(cè)定吸光度(A)，計(jì)算多糖的提取率，結(jié)果如表1所示。從表1可知，4種提取方法中，堿水提取法提取率最高，高達(dá)20.83%；而堿醇提取法提取率最低，僅為10.56%。其次，堿水提取法、水提法的提取率均高于醇提法和堿醇提取法的提取率，這可能是由于生殖營(yíng)養(yǎng)方中水溶性多糖較多的緣故。另外，堿水提取法比傳統(tǒng)的水提法的提取率高約4%，說(shuō)明堿水提取法改進(jìn)了生殖營(yíng)養(yǎng)方多糖的提取方法。

4 結(jié)論

堿水提取法的提取率最高，可為生殖營(yíng)養(yǎng)方多糖提取方法的研究提供參考。苯酚-硫酸比色法測(cè)定生殖營(yíng)養(yǎng)方多糖簡(jiǎn)單方便、準(zhǔn)確、可靠，且所需儀器簡(jiǎn)單、操作方便、顯色穩(wěn)定。

表1 多糖的提取率 (%，n=3)

5 討論

5.1 料液比對(duì)多糖提取率的影響

本研究曾考察了料液比分別為1∶60、1∶80和1∶100對(duì)多糖提取的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)料液比為1∶60時(shí)，提取后溶液中沉淀較多，而料液比1∶80和1∶100時(shí)沒有沉淀產(chǎn)生，且提取率較高。同時(shí)為了節(jié)約資源，我們選擇1∶80的料液比。

5.2 乙醇濃度對(duì)多糖提取率的影響

本研究曾考察了不同乙醇濃度對(duì)多糖提取率的影響，乙醇濃度分別為15%、30%、40%、50%。當(dāng)乙醇濃度40%和50%時(shí)，提取后發(fā)現(xiàn)提取液中會(huì)析出難溶性沉淀，影響多糖提取率，造成測(cè)定多糖含量時(shí)有很大誤差。而乙醇濃度15%和30%提取過(guò)程中不會(huì)析出難溶性沉淀，且乙醇濃度30%的多糖提取率較高，因此選擇乙醇濃度為30%。

5.3 堿水法提取多糖的優(yōu)勢(shì)和原因分析

多糖是極性大分子化合物，溶劑的酸堿性等對(duì)多糖提取具有較大影響。目前多采用不同溫度的水和稀堿溶液提取，盡量避免在酸性條件下提取[5]。本實(shí)驗(yàn)采用水提法、醇提法、堿水提取法、堿醇提取法來(lái)提取多糖，發(fā)現(xiàn)堿水提取多糖的提取率最高，這可能是由于堿溶液對(duì)植物細(xì)胞起到破壁作用[6]，而且生殖營(yíng)養(yǎng)方中水溶性多糖較多，使得多糖提取率提高。