師 聰 顏小梅 韋朝領(lǐng)

(1徐州工程學院，食品(生物)工程學院，江蘇 徐州 221018；2安徽農(nóng)業(yè)大學茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036)

褪黑素(melatonin，MT)是大腦里“松果體腺”分泌的一種荷爾蒙，是生命必需的吲哚胺類物質(zhì)[1-2]。褪黑素存在于各種植物中，具有很強的抗氧化性，可以大量清除活性氧和活性氮，同時它還起著信號分子的作用[3-5]，誘導或抑制與信號傳導[6]、細胞生長[7]、衰老[8]和葉綠素降解[9]相關(guān)的基因表達，進而影響植物生理功能。此外，褪黑素可通過提高防御相關(guān)酶的活性來提高植物的抗病性[10]。由于褪黑素的生理功能，植物已經(jīng)形成了與褪黑素合成相關(guān)的復(fù)雜系統(tǒng)來響應(yīng)各種環(huán)境刺激，如溫度[11-12]、水脅迫[11-13]、光照強度[2，14]以及內(nèi)源性信號分子乙烯和脫落酸[15]。

在高等植物中，色氨酸經(jīng)過4種酶碳化形成褪黑素。隨著研究的深入，催化合成褪黑素途徑相關(guān)編碼酶的基因相繼被克隆[15-17]。其中，5-羥色胺-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(N-acetylserotonin methyltransferase，SNAT)是褪黑素的合成途徑的關(guān)鍵限速酶，其可以催化5-羥色胺生成N-乙酰基-5-羥色胺(N-acetylserotonin)；N-乙?；?5-羥色胺是褪黑素合成的前體物質(zhì)，當其轉(zhuǎn)化成褪黑素急劇減少時，SNAT 催化反應(yīng)是最關(guān)鍵的調(diào)控步驟[18-19]。

在植物生長過程中，高溫、低溫、干旱和鹽漬等會限制植物生長發(fā)育和影響產(chǎn)量品質(zhì)[20-22]。茶樹(Camellia sinensis)作為我國重要的經(jīng)濟作物，其在生長發(fā)育的過程中往往會遭受蟲害等生物脅迫，以及低溫、干旱等非生物脅迫，嚴重影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)。SNAT基因在植物抗逆等生理活動中具有重要的作用，其抗逆的分子機制將為茶樹抗逆分子育種提供理論依據(jù)。本研究以茶樹為材料，克隆了CsSNAT全長序列，并進行序列特征、組織表達特異性分析及蛋白誘導表達，以期為深入解析該基因功能奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及前處理

以安徽舒城德昌2年生扦插苗盆栽為材料，品種為國家無性系良種舒茶早。茶尺蠖幼蟲采自安徽潛山茶場。選取長勢相對一致、健康、無病蟲害的舒茶早茶苗，分 別用100 μmol·L-1褪黑素(melatonin)、1 mmol·L-1水楊酸(salicylic acid，SA)、100 μmol·L-1脫落酸(abscisic acid，ABA)、1 mmol·L-1茉莉酸甲酯(含0.05% Tween-20，methyl jasmonate，MeJA)對葉片進行相同程度的均勻噴施，以清水處理的葉片為對照。取2～3 齡茶尺蠖幼蟲放于茶苗葉片上，每株放10 頭，待約1/3 葉片被取食后，將幼蟲移走，以未取食的葉片為對照。每個處理做3個生物學重復(fù)。處理3、6、9、12、24 h 后采集相同葉位的幼嫩葉片，并立即置于液氮中，放入-80℃超低溫冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 茶樹總RNA 提取及cDNA合成

按照RNAprep pure Plant Kit 提取試劑盒說明書[天根生化科技(北京)有限公司]，以葉片為材料提取總RNA，用ND-2000 核酸蛋白測定儀(美國Thermo Fisher 公司)檢測總RNA 樣品的濃度，DYC-31DN 電泳儀(北京六一生物科技有限公司)檢測總RNA的完整性。按照PrimeScriptTMReverse Transcriptase Kit 試劑盒(大連TaKaRa 公司)說明書以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 茶樹CsSNAT基因的全長克隆

利用Primer Premier 5 軟件分別設(shè)計3′-RACE和5′-RACE 引物(表1)，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，參照SMARTTMRACE (美國Clontech 公司)試劑盒說明書進行操作。PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收目的條帶并克隆，交由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司測序。測序結(jié)果利用Editseq 軟件進行拼接，根據(jù)拼接序列設(shè)計全長驗證引物(表1)。PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃反應(yīng)60 s，72℃延伸10 min，30個循環(huán)。膠回收目的條帶、克隆、測序。

1.4 茶樹CsSNAT基因生物信息學分析

蛋白的分子量和等電點利用ProtParam tool 網(wǎng)站計算。利用TMHMM2.0 預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，SignalP4.1 預(yù)測蛋白的信號肽，Scratch protein Predictor 預(yù)測蛋白質(zhì)的二硫鍵及二級結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MODEL 同源建模CsSNAT 蛋白的三級結(jié)構(gòu)，用NCBI 網(wǎng)站中的BLASTP 在線分析軟件和DNAMAN 軟件進行序列比對分析。采用MEGA6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)蛋白進化樹。

1.5 原核表達載體的構(gòu)建

根據(jù)CsSNAT完整開放閱讀框和pMal-c2X 載體，利用Primer Premier 5 設(shè)計帶有BamHI和SalⅠ酶切位點的上下游引物(表1)，參照TransStart FastPfuDNA Polymerase 試劑盒說明書擴增完整開放閱讀框(open reading frame，ORF)，擴增產(chǎn)物純化回收。用BamHI和SalⅠ分別酶切純化產(chǎn)物和pMal-c2X 載體，將雙酶切后的產(chǎn)物純化回收后，用T4 DNA 連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞。通過菌落PCR 鑒定陽性菌落，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，用BamHI和SalⅠ雙酶切驗證，然后挑取陽性菌落進行測序驗證。

1.6 原核表達和誘導條件優(yōu)化

參考文獻[23]的方法。挑取測序驗證正確的單克隆菌落接種于LB 培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，然后擴大培養(yǎng)至OD600為0.6 左右。取1 mL 菌液至1.5 mL 離心管中，10 000 r·min-1離心收集菌株。向剩余的菌液中加入50 μL 1 mol·L-1異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogala-ctoside，IPTG)，25℃誘導表達3 h，然后取出1 mL 菌液備用，并將最后剩余的誘導菌液于10 000 r·min-1條件下離心15 min，棄上清液。向沉淀中加入4 mL 1×PBS，用移液器充分吹打混勻，在超聲功率200 W條件下破碎處理15 min。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測蛋白表達情況，對照組為空載體pMal-c2X。

誘導溫度的優(yōu)化:培養(yǎng)重組子，按照上述操作，誘導條件為0.5 mmol·L-1IPTG，分別在16、28、37℃下誘導6 h 后取樣，用蛋白膠檢測蛋白的表達情況。

IPTG 濃度的優(yōu)化:培養(yǎng)重組子，按照上述操作，誘導條件分別為0.25、0.50、1.00、2.00 mmol·L-1IPTG，在28℃下誘導6 h 后取樣，用蛋白膠檢測蛋白的表達情況。

誘導時間的優(yōu)化:培養(yǎng)重組子，按照上述操作，誘導條件為0.5 mmol·L-1IPTG，28℃條件下分別誘導4、6、8 h 后取樣，并用蛋白膠檢測蛋白的表達情況。

1.7 原核表達蛋白的純化

選用麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose-binding protein，MBP)標簽融合蛋白進行目的蛋白純化，填料用直鏈淀粉樹脂(Amylose Resin)。吸取2 mL 填料放入柱子中，菌液經(jīng)破碎離心后，過濾上清液，然后把上清液加入填有填料的柱中，利用液體的重力使上清液緩慢流過樹脂，帶有MBP 標簽的融合蛋白會結(jié)合在樹脂上，用柱緩沖液(Column Buffer)洗脫未結(jié)合蛋白，用麥芽糖Column Buffer 把目的蛋白洗出，經(jīng)過超濾濃縮后，用蛋白膠檢測蛋白純化的效果。

1.8 CsSNAT基因的表達分析

實時熒光定量PCR 分析不同處理后CsSNAT的表達特征。提取不同時間點處理樣品的總RNA，參照大連TaKaRa 公司SYBR? PrimeScriptTMRT-PCRKit 說明書，反轉(zhuǎn)錄成RT-qPCR 模板。用Primer Premier 5 軟件設(shè)計基因RT-qPCR的引物(表1)。經(jīng)引物特異性和擴增效率驗證后，以茶樹GAPDH為內(nèi)參基因，參照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(大連TaKaRa 公司)說明書操作，基因相對表達水平采用2-ΔΔCt法[24]計算。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 CsSNAT基因的全長克隆

根據(jù)篩選的CsSNAT的EST 序列，以茶樹葉片cDNA為模板，采用RACE 技術(shù)進行非嵌套和嵌套擴增，最終獲得3′末端序列長度為542 bp(圖1-A)，5′末端序列長度為650 bp(圖1-B)。對分別獲得的CsSNAT3′端和5′端進行全長拼接，用設(shè)計的全長引物進行cDNA 全長的特異性擴增，通過克隆測序獲得CsSNAT全長為1 014 bp(圖1-C)。

圖1 CsSNAT 全長克隆的擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the CsSNAT full-length products

2.2 CsSNAT基因的生物信息學與系統(tǒng)進化樹分析

根據(jù)測序正確的CsSNAT基因全長序列進行生物信息學分析，CsSNAT基因全長序列包含742 bp ORF，編碼247個氨基酸，分子量為27.36 kDa，等電點為7.64。CsSNAT的蛋白序列N 端未發(fā)現(xiàn)信號肽結(jié)構(gòu)，且未發(fā)現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于跨膜蛋白。Scratch protein Predictor 預(yù)測顯示，CsSNAT 存在3個二硫鍵，預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)表明，CsSNAT 中α-螺旋(H)、β-折疊(E)和無規(guī)卷曲(L)的比例為23.89∶22.67∶53.44。CsSNAT 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，無規(guī)則卷曲是該蛋白結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)組成部分(圖2)。

利用軟件MEGA6.0 中的N-J 方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。由圖3可知，SNAT 大致可以分為兩大類，其中，CsSNAT與VvSNAT(CBI31163)同源性最高，達到了66.19%，與經(jīng)過功能驗證的AtSNAT(At1g32070)、OsSNAT(Os05g0481000)和PtSNAT(XM＿002323058)相似度分別為5 4.3 2%、5 5.0 4%和6 4.0 3%。對CsSNAT 氨基酸序列進行多重序列比對分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)這些不同種類的CsSNAT 蛋白都具有乙酰輔酶A的保守結(jié)構(gòu)域。

圖2 CsSNAT 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Tertiary structure prediction of CsSNAT protein

圖3 CsSNAT 蛋白與不同種類的SNAT 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic trees of CsSNAT proteins and different kinds of SNAT proteins

2.3 CsSNAT基因原核表達條件優(yōu)化和蛋白純化

用帶有BamHI和SalⅠ酶切位點的上下游引物對CsSNAT的ORF 進行擴增，得到一條約為740 bp的條帶，將膠回收產(chǎn)物和pMal-c2X 分別用BamHI和SalⅠ進行雙酶切，用T4 DNA 連接酶16℃連接過夜，構(gòu)建原核表達pMal-c2X/CsSNAT質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細胞，對單克隆菌落進行PCR，篩選獲得陽性菌，提取質(zhì)粒后用BamHI和SalⅠ雙酶切鑒定。由圖5可知，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后得到了2條帶，其中一條在740 bp 左右，經(jīng)測序驗證與CsSNAT完全一致，表明表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

將質(zhì)粒 pMal-c2X/CsSNAT轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3) pLysS 后，對CsSNAT進行蛋白表達條件優(yōu)化，試驗結(jié)果表明，CsSNAT 蛋白以可溶蛋白和包涵體蛋白2種形式同時存在，最佳誘導條件為溫度28℃，IPTG 濃度0.5 mmol·L-1，誘導時間6 h(圖6)。在此條件下誘導表達時，可溶性蛋白達到最大量(圖7-A)。由SDS-PAGE 結(jié)果可知，在分子質(zhì)量約為66 kDa 處有明顯的新增蛋白帶，而空載體對照在此處無表達條帶。此外，因為表達載體中含有重組麥芽糖結(jié)合蛋白，所以表達的分子量較預(yù)測大。

圖4 CsSNAT 與其他植物的SNAT 序列比對分析Fig.4 Alignment of amino acid sequences of CsSNAT and other plant SNAT

圖5 重組質(zhì)粒雙酶切驗證的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.5 Agarose gel electrophoresis of analysis of recombinant plasmid digested with double enzymes

基于誘導表達的CsSNAT 重組蛋白為帶有麥芽糖標簽的融合蛋白，利用親和柱中的直鏈淀粉樹脂可以與上樣液中的目的蛋白特異性結(jié)合，通過親和層析純化和濃縮樣品。由圖7-B可知，純化的目的蛋白條帶清晰且無雜帶。

2.4 不同激素處理后CsSNAT基因的表達特征分析

采用RT-qPCR 對CsSNAT基因在茶尺蠖取食、褪黑素、SA、ABA和MeJA 處理后的表達進行檢測。由圖8可知，茶樹經(jīng)100 μmol·L-1ABA 處理后，CsSNAT在6、9和12 h 均為上調(diào)表達，其中12 h 顯著上調(diào)，約為CK的1.4倍(圖8-A)；茶樹經(jīng)1 mmol·L-1MeJA 處理后，CsSNAT基因在處理9 h時顯著上調(diào)表達，約是CK的2倍，在其他時間點均為下調(diào)表達(圖8-B)；茶樹經(jīng)1 mmol·L-1SA 處理后，CsSNAT在各個時間點均為下調(diào)表達(圖8-C)。在茶尺蠖取食后，CsSNAT經(jīng)誘導6和9 h時顯著上調(diào)，分別約為CK的1.5和1.3倍(圖8-D)；在100 μmol·L-1褪黑素處理后，CsSNAT在處理3 h 內(nèi)下調(diào)，6、9和12 h時顯著上調(diào)表達，6 h時表達量最高，約是CK的3倍(圖8-E)。不同處理下CsSNAT基因表達量均有不同程度變化，說明CsSNAT基因可能參與生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

3 討論

褪黑素作為植物中有效的內(nèi)源性自由基清除劑，通過參與多胺等物質(zhì)的合成，或調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)酶的基因轉(zhuǎn)錄水平，扮演著植物中第一道防線的角色[25]，來防止生物脅迫和非生物脅迫對植物的傷害。本研究克隆了褪黑素合成途徑的關(guān)鍵限速酶基因CsSNAT，該基因全長1 014 bp，編碼247個氨基酸，無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)，但具有乙酰輔酶A的保守結(jié)構(gòu)域。

圖6 不同IPTG 濃度、溫度和時間誘導下CsSNAT的SDS-PAGE 分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of the CsSNAT with different induction concentration of IPTG、temperature and treatment time

圖7 CsSNAT 誘導表達和純化的SDS-PAGE 分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of the CsSNAT expressed and purified

圖8 不同激素處理后CsSNAT基因相對表達量的RT-qPCR 分析Fig.8 RT-qPCR analysis of CsSNAT genes relative expression levels in Camillia sinesis treated with different hormones

大腸桿菌表達系統(tǒng)是技術(shù)最成熟、開發(fā)最早的外源蛋白原核表達系統(tǒng)[26]。質(zhì)粒載體pMal-c2X是一種高效原核表達載體，其含有麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的大腸桿菌MalE基因。MBP 融合標簽在可溶性蛋白表達上具有明顯的優(yōu)勢，它能夠引導重組蛋白的正確折疊，在一定程度上增加所表達蛋白的可溶性。此外，利用麥芽糖與MBP的特異性結(jié)合的特點，可采用親合層析的方法分離和純化融合蛋白。本研究構(gòu)建了pMalc2X/CsSNAT質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株中，經(jīng)IPTG 誘導發(fā)現(xiàn)，CsSNAT 蛋白以可溶蛋白和包涵體蛋白2種形式同時存在。為了獲取大量可溶性蛋白，本研究探索了不同誘導時間、不同IPTG 濃度和不同誘導溫度對融合蛋白的表達的影響，結(jié)果顯示，在28℃、0.5 mmol·L-1IPTG、6 h條件下誘導表達時，CsSNAT的可溶性蛋白達到最大量。因表達的融合蛋白攜帶MBP的融合標簽，本研究利用直鏈淀粉樹脂與目的蛋白特異性結(jié)合，通過親和層析提純目的蛋白。由SDS-PAGE 結(jié)果可知，純化的目的蛋白條帶清晰且無雜帶，為CsSNAT 蛋白的功能研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

本研究檢測了CsSNAT基因在茶尺蠖取食、褪黑素、SA、ABA和MeJA 處理后的表達模式，證實該基因與茶樹的逆境響應(yīng)密切相關(guān)。外源激素的噴施對植物生長也具有重要的調(diào)控作用，SA、ABA和MeJA 刺激能夠快速誘導植物響應(yīng)。本研究結(jié)果表明，ABA和MeJA 分別在處理12 h和9 h 后，CsSNAT均顯著上調(diào)表達。但CsSNAT基因的表達在SA 處理過程中呈下調(diào)模式，表明該基因在SA 響應(yīng)中可能起負調(diào)控作用。結(jié)合SA、ABA和MeJA 三者都在植物的抗逆過程中發(fā)揮重要作用，推測CsSNAT可能與茶樹抗逆有關(guān)。本研究中，茶尺蠖取食6 h 后，CsSNAT基因發(fā)生了顯著變化，推測CsSNAT基因可能具有抗蟲作用。褪黑素是一種植物內(nèi)源激素[27]，而外源激素與內(nèi)源激素具有協(xié)同與拮抗作用，噴施外源激素后內(nèi)源激素也發(fā)生了相應(yīng)的變化[28]。Arnao 等[29]發(fā)現(xiàn)外源褪黑素經(jīng)大麥根吸收后，也會誘導內(nèi)源褪黑素含量增加；Sun 等[30]用500 μmol·L-1褪黑素處理番茄后，番茄內(nèi)褪黑素含量約是對照的31倍。外源褪黑素處理后CsSNAT能夠快速誘導表達，從而加快褪黑素前體物質(zhì)的合成。CsSNAT基因在植物抗逆、抗蟲過程中是否發(fā)揮作用，尚需要通過遺傳轉(zhuǎn)化等手段進行驗證。

4 結(jié)論

本研究從茶樹中克隆了一條CsSNAT基因的cDNA 全長序列，該基因編碼247個氨基酸，分子量為27.36 kDa。多序列比對分析表明，茶樹CsSNAT 在結(jié)構(gòu)和同源性方面與其他植物存在著一定的差異，但不同種類的CsSNAT 蛋白都具有乙酰輔酶A的保守結(jié)構(gòu)域；進化樹分析表明，茶樹CsSNAT 氨基酸序列在進化上與同為木本的葡萄和楊樹在同一分支上，說明它們在同源關(guān)系上最為接近。通過構(gòu)建pMal-c2X/CsSNAT質(zhì)粒，優(yōu)化蛋白表達條件，發(fā)現(xiàn)在溫度28℃、誘導劑0.5 mmol·L-1IPTG、誘導時間6 h條件下，可溶性蛋白達到最大量。RT-qPCR 分析表明，CsSNAT基因可能參與生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。本研究結(jié)果為進一步探究CsSNAT基因的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。