徐晶晶 苑 平 柏浩東 廖海民 李祖任

(1貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，雜草生物學(xué)及安全防控生物學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410125)

小飛蓬[Conyza canadensis(L.) Cronq.]是一種常見的旱地惡性雜草，其對經(jīng)濟作物、果園和茶園危害嚴重[1]。同時，小飛蓬對化學(xué)除草劑草甘膦和百草枯產(chǎn)生了嚴重的抗藥性，抗性小飛蓬的治理迫切需要開發(fā)安全(包括生物安全和生態(tài)安全)的新型除草劑[2]。植物源除草劑正是雜草控制和新型生物源除草劑的研究方向。目前，我國已經(jīng)形成了一批具有自主知識產(chǎn)權(quán)的生物除草劑技術(shù)成果，但尚未研制出成分完全為生物來源的除草劑種類，主要原因是生物除草劑本身的生態(tài)適應(yīng)相對較差[3-4]。因此，發(fā)掘利用生物除草劑關(guān)鍵資源顯得尤為重要，對致力于突破生物除草劑產(chǎn)品開發(fā)的成本、環(huán)境等限制的功能性研究也不可或缺[5-6]。

前期研究表明，羊脂酸對小飛蓬、稗草等旱地雜草具有良好的抑制效果[7]。進一步推測羊脂酸抑制小飛蓬的機理可能是通過破壞類囊體膜中捕光蛋白復(fù)合體(light-harvesting complex，LHC)的功能，從而破壞小飛蓬葉綠體結(jié)構(gòu)，引起葉綠素含量變化，影響其光合作用而殺滅小飛蓬[8-9]。

LHC是一種色素-蛋白復(fù)合物，可捕獲光能并迅速將能量傳遞到反應(yīng)中心，引起光化學(xué)反應(yīng)。光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ都有各自的LHC[10]。在正常光強條件下，LHCⅡ高效地吸收光能，并迅速將其傳遞至光合反應(yīng)中心以引起光化學(xué)反應(yīng)；在脅迫光強條件下(包括過強或過弱光照條件)，LHCⅡ通過結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)整，可有效調(diào)節(jié)類囊體膜的能量平衡，尤其是在強光下能以非光化學(xué)淬滅方式耗散過剩激發(fā)能，進而保護光合器官免遭傷害，從而使光合作用高效進行[11]。瞿玉山等[12]克隆了甘蔗Lhc-a3 基因，定位于葉綠體，無信號肽，有3個不同的跨膜區(qū)，是親水性分泌膜蛋白。陳衛(wèi)民等[13]研究發(fā)現(xiàn)鹽生杜氏藻捕光蛋白基因Lhcb家族成員在強光照下的表達整體受到抑制(lhc-b1、lhcb2.1、lhc-b2.2 在強光照處理3 h時表達積累量最低)。但這些研究主要集中于LHC基因的表達差異以及LHC 蛋白的結(jié)構(gòu)和起源進化等，而對于LHC 蛋白與除草劑脅迫相關(guān)的功能解析鮮有涉及。

結(jié)合前期研究，本研究以羊脂酸處理后的小飛蓬葉片為試驗對象，圍繞響應(yīng)羊脂酸處理的捕光蛋白Lhc-Z6基因，依次開展以下工作:采用cDNA 末端快速擴增技術(shù)克隆Lhc-Z6基因，對該基因的功能結(jié)構(gòu)域等信息進行預(yù)測分析；基于最大似然法構(gòu)建該基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，并闡明系統(tǒng)進化關(guān)系；采用RT-qPCR 方法研究羊脂酸處理后不同時間內(nèi)小飛蓬葉片中Lhc-Z6基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的差異，以期為揭示光捕獲蛋白在小飛蓬響應(yīng)羊脂酸過程中的調(diào)節(jié)機制奠定基礎(chǔ)，同時為植物源羊脂酸產(chǎn)品研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要試劑

小飛蓬種子收集于湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗大樓旁荒地，將種子用赤霉素催芽，分別放置于內(nèi)徑為20 cm的小盆子內(nèi)，于光照16h、光照強度100～120 μmol·m-2·s-1、溫度18～20℃條件下培養(yǎng)，待幼苗長至三葉期時備用。97%羊脂酸(自制)，采用蒸餾萃取法提取于椰子油中。

PrimeScript 1st Strand eDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、CLONETECH SMARTer RACE5′/3′Kit RACE試劑盒，大連TaKaRa 公司；SYBR Green Real-time PCR Master MIX，東洋紡(上海)生物科技有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)色譜純或分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

LightCycler 96 實時PCR 儀，瑞士Hoffman·Roche公司；凝膠成像系統(tǒng)Kodak Gel Logic 200，美國EASTMAN KODAK 公司；Brocade DHP-9020恒溫培養(yǎng)箱，山東博科科學(xué)儀器有限公司；WWWP-2000 行走式噴霧塔，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南京機械化研究所。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA的提取和cDNA 第一鏈的合成 取1 000 μL 羊脂酸，加入30 mL 蒸餾水，用噴霧塔均勻噴霧于小飛蓬葉片，分別于羊脂酸處理0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 h時收集適量小飛蓬葉片，用蒸餾水洗滌，并用吸水紙快速干燥，置于液氮中。經(jīng)液氮研磨后，通過Trizol 法提取總RNA，通過2% RNA 瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的純度和完整性，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 第一鏈[14]。

1.3.2 cDNA 序列片段的獲取 采用同源克隆策略，根據(jù)已報道的LHC基因cDNA 序列，選擇保守性高的位點設(shè)計簡并引物CocZ6-1和CocZ6-2(表1)。以cDNA為模板，PCR 擴增目的基因片段。25 μL PCR反應(yīng)體系:cDNA 模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Mix 12.5 μL，去離子水9.5 μL。PCR 反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃延伸7 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收后，將其連接到pMD18-T 載體中并轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細胞中。挑選陽性克隆送至上海生物科技有限公司進行測序，并將得到的序列與GenBank 中獲得的序列進行BLAST 同源性分析[15]。

1.3.3 RACE擴增 根據(jù)已獲得的部分cDNA片段，分別設(shè)計5′和3′RACE特異引物(表1)，按照CLONETECH SMARTer RACE5′/3′Kit 擴增試劑盒說明進行擴增，并直接對擴增產(chǎn)物進行測序。將PCR 產(chǎn)物構(gòu)建成T 克隆并測序，電泳檢測和克隆測序步驟與

1.3.2 相同。

1.3.4 序列生物信息學(xué)分析 使用NCBI的BLAST進行序列同源性比對和相似性搜索。用ExPaSy website (http:/ /us.expasy.Org/tools/pitoo1.htm)預(yù)測計算該基因的分子量和等電點(molecular weight/isoelectric point)MW/pI；在GenBank 中找到涉及LHC的相關(guān)蛋白氨基酸序列，選取17個典型的植物蛋白；運用軟件ClustalX和Mega 4.1 以鄰接法(neighborjoining，NJ) 構(gòu)建進化樹；1 000次自舉(Bootstrap) 分析計算各節(jié)點支持率[16]。

1.3.5CcLhc-z6基因mRNA 響應(yīng)羊脂酸的時間表達分析 使用靶基因特異性引物qR-Z6和內(nèi)部參照基因ACTIN 擴增引物(表1)，按照SYBR Green PCR Mix 試劑盒說明書進行操作。反應(yīng)體系20 μL:SYBR Premix ExTaqTM 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序:95℃變性30 s，58℃退火20 s，循環(huán)40次。使用2-△△CT法比較靶基因的表達。在Prism 4.0 軟件中使用雙尾T 檢驗法對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，以P＜0.05表示具有差異顯著性[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CcLhca-Z6基因序列的獲得

以提取的小飛蓬葉片總RNA 逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 作為模板進行PCR 克隆。先使引物CocZ6-1簡并化并用CocZ6-2 進行PCR 得到了1條約為450 bp的片段(圖1-a)，再通過再循環(huán)、連接、轉(zhuǎn)化和測序獲得核心CcLhca-Z6基因序列。擴增cDNA 5′端序列，使用引物CocZ6-R1 進行第一輪PCR，擴增產(chǎn)物用CocZ6-R2和CocZ6-R3 引物進行第二輪PCR，得到1條約為400 bp的片段(圖1-b)。通過回收、連接、轉(zhuǎn)化和測序，獲得cDNA 5′末端序列。擴增cDNA的3′末端序列，并使用CocZ6-F1 引物進行第一輪PCR，再用CocZ6-F2 引物對擴增產(chǎn)物進行第二輪PCR，得到1條約為600 bp的片段(圖1-c)。將獲得的5′ RACE 序列、核心序列以及3′ RACE 序列剪接，從而獲得CcLhca-Z6基因cDNA 序列全長(圖2)。

表1 小飛蓬捕光蛋白Lhca-Z6基因克隆及RT-qPCR表達引物Table1 The primers used for cloning Lhca-Z6 of Conyza canadensis and RT-qPCR

圖1 CcLhca-Z6基因的擴增結(jié)果Fig.1 Amplification results of the CcLhca-Z6 gene

2.2 CcLhca-Z6基因生物信息學(xué)分析

通過RACE 獲得CcLhca-Z6基因(命名為CcLhca-Z6)的全長cDNA 序列，基因閱讀框長1 016 bp，編碼266個氨基酸(圖2)。ProParam 預(yù)測編碼蛋白分子質(zhì)量為28.14 kDa，理論等電點為5.29，是一種酸性蛋白質(zhì)。該蛋白中丙氨酸數(shù)量最多，有34個，占總數(shù)的12.8%；其次是甘氨酸和亮氨酸，數(shù)量分別為33和25個，各占總數(shù)的12.4%和9.4%。BLASTP 對LHCI-Z6蛋白保守區(qū)的預(yù)測表明，該蛋白屬于Chloroa＿b-bind家族，包含典型的捕光葉綠素a/b 結(jié)合蛋白功能(圖3)。系統(tǒng)進化分析表明，不同物種來源的Lhca 蛋白在進化上分屬不同分支，其中CcLhca-Z6 蛋白與黃花蒿(PWA84283.1) 蛋白進化程度最為接近，與萵苣(XP023739911.1)進化接近程度次之，均處于同一分支；CcLhca-Z6 蛋白與大薊(XP024987521.1)、向日葵(XP022012027.1)關(guān)系較近，與番茄(NP001316912.1)、馬鈴薯(XP006356077.1)關(guān)系較遠(圖4)。

圖3 CcLhca-Z6 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.3 Functional domains predicted for CcLhca-Z6

圖4 CcLhca-Z6 與近緣種群的進化分析Fig.4 Phylogenetic tree of CcLhca-Z6 with homologous proteins from other species

2.3 羊脂酸處理對小飛蓬CcLhca-Z6基因表達的影響

由圖5可知，隨著羊脂酸處理時間的延長，小飛蓬葉片中CcLhca-Z6基因的相對表達量呈先升高后降低的趨勢，在處理時間為2 h時，CcLhca-Z6基因的相對表達量達到最大值，為對照(處理0 h)的20.63倍，此結(jié)果與前期蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相似[8]。這可能是由于羊脂酸脅迫能誘導(dǎo)小飛蓬Lhca-Z6基因表達，但脅迫時間較長(大于2 h)后小飛蓬機體受到損傷，不能再大量表達Lhca-Z6基因，因此該基因的mRNA 水平在2 h 后呈現(xiàn)逐步降低的趨勢。

圖5 羊脂酸處理對CcLhca-Z6基因相對表達的影響Fig.5 Effect of caprylic acid treatment on relative expression of CcLhca-Z6

3 討論

研究表明，大戟科的蓖麻、麻風(fēng)樹、木薯和橡膠樹分別含有6、6、9和9個Lhca基因，分屬于Lhca1、Lhca2、Lhca3、Lhca4、Lhca5和Lhca6 等6個亞家族，每個亞家族含有1～2個成員，基因內(nèi)含子數(shù)量在2～5之間[18]。而李利超等[19]采用生物信息學(xué)的方法研究發(fā)現(xiàn)，毛竹共有29個LHC基因同源序列，Wei 等[20]采用單粒子冷凍電子顯微鏡技術(shù)解析了LHCII的結(jié)構(gòu)，其為同型二聚體超分子系統(tǒng)，每個單體均含有25個蛋白亞族、105個葉綠素、28個類胡蘿卜素和其他輔助因子。同時 Berg 等[21]首次報道了布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)的LHCs，它是由單體和三聚體形成的多聚復(fù)合物。綜上，在多種植物中Lhca基因的分類和結(jié)構(gòu)已得到較為深入的研究，在擬南芥中也有關(guān)于Lhca基因的研究報道[22]，但相對而言，有關(guān)菊科植物的Lhca基因的研究還較少且不夠系統(tǒng)。本研究從菊科植物小飛蓬葉片中克隆了一個Chloroa＿b-bind家族成員CcLhca-Z6的cDNA 序列，系統(tǒng)進化分析表明，小飛蓬與黃花蒿(PWA84283.1)蛋白進化程度最為接近。

作為光合作用過程中最重要的復(fù)合物之一，PSⅠ和PSⅡ在電子轉(zhuǎn)移、抵抗逆境及狀態(tài)轉(zhuǎn)換等方面起著重要作用。而作為PSⅠ中重要的組成部分，LHCⅠ蛋白通過與葉綠素的結(jié)合在光合作用中極其關(guān)鍵[23]。LHC基因編碼的蛋白分別屬于光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ的捕光色素結(jié)合蛋白家族LHCⅠ和LHCⅡ；29個蛋白均包含導(dǎo)肽和成熟蛋白，具有跨膜結(jié)構(gòu)域，均包含色素結(jié)合位點；且大多數(shù)LHC基因主要在葉片和花序中表達[19]。寧璞等[24]通過基因組步移技術(shù)克隆雌性和雄性配子體中的5′-側(cè)翼序列，并明確了其具有啟動子功能。高等植物中Lhca和Lhcb基因的表達主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，啟動子是該調(diào)控的一個重要組成部分[25]。本研究也得到了一致的結(jié)論，即小飛蓬CcLhca-Z6基因表達的調(diào)控能在轉(zhuǎn)錄水平進行，但其具體的調(diào)控機制仍有待后續(xù)研究。同時，今后仍需明確小飛蓬葉片中CcLhcz-Z6的表達量是否受捕光蛋白基因啟動子多樣性的影響。

Gonzalez 等[26]從轉(zhuǎn)錄和蛋白產(chǎn)物的角度探明了耐除草劑基因aad-1的7個調(diào)控原件特性，為下一步在玉米育種中設(shè)計單基因或多基因構(gòu)圖上提供了有效信息。因此，發(fā)掘利用響應(yīng)羊脂酸抑制小飛蓬的關(guān)鍵基因CcLhca-Z6，明確其編碼框全長序列、基因結(jié)構(gòu)、啟動子功能等關(guān)鍵信息，可為后續(xù)基因功能驗證提供基礎(chǔ)。

據(jù)報道，在LHC基因家族中，Lhca和Lhcb基因的表達受多種應(yīng)激(如氧脅迫、鹽脅迫)的調(diào)節(jié)[27-28]。LHC 復(fù)合體的多基因在光、溫度、水、營養(yǎng)等環(huán)境的變化過程中，必然會通過改變其編碼組成的亞基結(jié)構(gòu)來發(fā)揮適應(yīng)環(huán)境變化的重要作用。在光調(diào)節(jié)過程中，整體高光抑制Lhcb基因的表達，而黑暗條件誘導(dǎo)表達，每個基因的表達都有細微的差異，這可能是植物適應(yīng)環(huán)境的一種方式[29-30]。Bjorkman 等[30]研究表明，水分脅迫使光合作用系統(tǒng)傾向于發(fā)生光抑制，同時植物經(jīng)水分脅迫時，任何降低激發(fā)能量或以非破壞方式耗散能量的機制都會降低對光合作用系統(tǒng)的損害程度。Deng 等[31]通過半定量PCR和Northern 雜交分析發(fā)現(xiàn)，LeLhc-b2 基因的表達受4℃和NaCl 誘導(dǎo)。在低溫條件下LeLhc-b2 基因通過滲透脅迫和氧化脅迫應(yīng)激來抑制其過表達。Kong 等[32]采用RT-qPCR和Northern雜交分析表明，LeCD-J1 基因在葉綠素含量高的葉片中表達量高，同時該基因的表達受溫度(4、38、42、45℃)、NaCl、PEG、MV和H2O2的誘導(dǎo)，其表達水平隨著應(yīng)激處理時間的延長而變化。本研究結(jié)果顯示，羊脂酸處理小飛蓬葉片0～8 h 后，CcLhca-Z6基因的表達存在顯著差異，推測CcLhca-Z6基因可能是小飛蓬響應(yīng)羊脂酸脅迫的關(guān)鍵基因。

4 結(jié)論

本研究克隆了小飛蓬的CcLhca-Z6基因，其序列全長1 016 bp，編碼266個氨基酸，分子量為28.14 kDa，理論等電點為5.29。系統(tǒng)進化分析表明，小飛蓬與黃花蒿(PWA84283.1)蛋白進化程度最為接近。羊脂酸處理顯著影響小飛蓬葉片CcLhca-Z6基因表達，并隨著處理時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。本研究結(jié)果為揭示捕光蛋白在小飛蓬響應(yīng)羊脂酸過程中的調(diào)節(jié)機制奠定了基礎(chǔ)，也為植物源羊脂酸產(chǎn)品研發(fā)提供了依據(jù)。而在小飛蓬葉片內(nèi)Lhca的表達量是否受捕光蛋白基因啟動子多樣性的影響及其影響機制，以及羊脂酸脅迫下小飛蓬差異表達的其他相關(guān)基因及功能仍有待進一步深入研究。