姚莉梅 尚昆 朱青青 江龍

(貴州大學(xué)，貴陽，550025)

合江方竹(ChimonobambusahejiangensisC.D.Chu et C.S.Chao)是禾本科竹亞科寒竹屬植物，是中國的特有種，主要的分布區(qū)包括四川合江、貴州赤水和貴州習(xí)水等地，生長海拔為800～1200m。因其出筍期在出筍淡季，且自身營養(yǎng)比較豐富，通過加工成鮮筍或干筍的形式進(jìn)行銷售，深受市場歡迎，開發(fā)價(jià)值很高[1]。叢枝菌根(AM)真菌是球囊菌門(Glomeromycota)的一類專性活體營養(yǎng)共生菌[2]，80%以上的植物都能被AM真菌侵染形成共生體[3]，通過共生體AM真菌能促進(jìn)植物對N、P、K等礦質(zhì)元素及微量元素的吸收和利用，增強(qiáng)植物的抗旱、抗寒和鹽脅迫等抗逆性，促進(jìn)植物生長，加快幼苗成活，促進(jìn)農(nóng)林業(yè)發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，竹類與AM真菌也存在共生關(guān)系，可以在土壤中形成共生體以促進(jìn)竹類植物的生長[4]，但在方竹方面相關(guān)研究較少，僅見葉文蘭等[5]報(bào)道了金佛山方竹(Chimonobabusautilis)根圍AM真菌種類，關(guān)于合江方竹共生AM真菌資源研究未見報(bào)道。本研究以合江方竹根際土壤為研究對象，對合江方竹根系進(jìn)行侵染調(diào)查研究，并從根際土壤中分離AM真菌孢子，通過形態(tài)學(xué)特征對合江方竹AM真菌進(jìn)行種屬鑒定，探明與合江方竹共生的AM真菌種類及多樣性狀況，為AM真菌在合江方竹上的應(yīng)用，特別是菌根苗生產(chǎn)中的菌種篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

土樣采集：采樣地位于貴州省遵義市赤水市大同鎮(zhèn)合江方竹天然林分布區(qū)，海拔831～1 050 m。選取長勢良好的合江方竹，采集根系和根際土壤。采樣時(shí)，挖除土壤表面約2 cm的土壤及雜質(zhì)，采集距地表5～30 cm土層中合江方竹根系和根際土壤，3株重復(fù)，混合后約1 kg，放入采集袋中，待根際土壤自然風(fēng)干后，放入冰箱中4 ℃進(jìn)行保存，備用。用自來水將根系表面土壤雜質(zhì)洗凈后，放進(jìn)廣口瓶，用FAA固定液固定備用[6]。

根系侵染狀況與侵染率：采用堿解離-酸性品紅染色法觀察根系菌根侵染狀況[7]。從FAA固定液中取出根系，清水沖洗2～3次后將根系裁剪為1 cm的小段，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaOH溶液在90 ℃水浴鍋中解離1 min，水洗3～5次，用30% H2O2在90 ℃水浴鍋中酸化0.5～1.0 min，水洗3～5次。根段用酸性品紅乳酸甘油染色2 d，取出進(jìn)行制片，并置于Olympus BX53光學(xué)顯微鏡下觀察，記錄每條根段各種菌根結(jié)構(gòu)(菌絲、泡囊和根內(nèi)孢子等)的侵染情況，根據(jù)每條被侵染菌根的根段長度所占根段總長度的百分比，按加權(quán)法[8]計(jì)算根段侵染率，共統(tǒng)計(jì)50根，3次重復(fù)。

侵染率=∑((0×未侵染的根段數(shù))+(10%×侵染率為10%的根段數(shù))+(20%×侵染率為20%的根段數(shù))+…+(100%×侵染率為100%的根段數(shù)))/觀察的總根段數(shù)。

AM真菌的分離與鑒定：采用濕篩傾注-蔗糖離心法[9]對土壤AM真菌孢子進(jìn)行分離。將分離后的孢子置于體式顯微鏡下挑選成熟孢子，用無菌槍頭吸取孢子于載玻片上，以水為載浮劑，置于生物顯微鏡(Olympus BX53)和攝影系統(tǒng)(Olympus DP70)下，對孢子大小、形狀、顏色、連孢菌絲、孢子壁及發(fā)芽壁的層數(shù)和厚度、孢子壓破后的內(nèi)含物及在Melzer’s試劑中的染色情況、孢子表面有無紋飾或附著物等特征進(jìn)行詳細(xì)觀察、記錄，并照相[10]。依據(jù)國際叢枝菌根真菌保藏中心(INVAM，http://invam.caf.wvu.edu)、http://www.amf-phylogeny.com和http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota等網(wǎng)站提供的種屬描述及其相應(yīng)的圖片，結(jié)合貴州大學(xué)AM真菌保藏資源進(jìn)行種屬鑒定，中文學(xué)名參見王幼珊等[11]球囊菌門叢枝菌根真菌最新分類系統(tǒng)菌種名錄。

物種多樣性分析：按上述孢子分離方法，每個(gè)土樣重復(fù)3次，測定以下指標(biāo)，孢子密度(SD)為20 g風(fēng)干土樣中孢子的總數(shù)；相對多度(RA)為該采樣點(diǎn)某種孢子數(shù)占該采樣點(diǎn)總孢子數(shù)的比例；相對頻度(RF)=(某個(gè)種的頻度/所有種的頻度總和)×100%；重要值I=(RF+RA)/2，即頻度和相對多度的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 合江方竹根系侵染狀況

鏡檢觀察合江方竹根系的AM真菌侵染情況(圖1)，其菌根侵染率為23%，其中菌絲和泡囊是AM真菌侵染根系的主要形式(圖1A、B)，此外也可觀察到根系表面存在根內(nèi)孢子(圖1C)，說明AM真菌可侵染合江方竹根系，能與之建立起良好的共生關(guān)系。

V.泡囊；H.菌絲；S.根內(nèi)孢子。

2.2 合江方竹根際AM真菌的鑒定

經(jīng)過孢子形態(tài)學(xué)的鑒定，從貴州省赤水市合江方竹根際土壤中共分離、鑒定出AM真菌8屬24種，其中無梗囊霉屬(Acaulospora)10種，多樣孢囊霉屬(Diversispora)1種，盾巨孢囊霉屬(Scutellospora)1種，巨孢囊霉屬(Gigaspora)1種，球囊霉屬(Glomus)6種，隔球囊霉屬(Septoglomus)2種，硬囊霉屬(Sclerocystis)1種，雙型囊霉屬(Ambispora)2種，詳見圖2。

2.3 AM真菌多樣性

由表1可知，球囊霉屬和無梗囊霉屬為合江方竹根系A(chǔ)M真菌優(yōu)勢屬，柯氏無梗囊霉(A.koskei)、小果球囊霉(G.microcarpum)、長孢球囊霉(G.dolichosporum)為優(yōu)勢種。

3 結(jié)論與討論

筆者在染色的合江方竹根系中觀察到根內(nèi)孢子、菌絲和泡囊等結(jié)構(gòu)，說明AM真菌能夠侵染合江方竹根系，其侵染率為23%，表明AM真菌能與合江方竹建立較好的共生關(guān)系。該研究結(jié)果與葉文蘭等[7]發(fā)表的金佛山方竹侵染率相差不大，但是與其他植物如甘蔗(Saccharumofficinarum)[29]、玉米(Zeamays)[30]、櫨橘木(Noueliainsignis)[31]、胡楊(Populuseuphratica)和駱駝刺(Alhagisparsifolia)[32]相比，侵染率并不高。不同植物之間侵染率有一定的差異性，研究表明，土壤類型[33]、質(zhì)地、土壤中的養(yǎng)分情況[34]、土壤pH[35]、溫度[36]及濕度[37]都會對菌根侵染率造成影響，除此之外植物與AM真菌的親和程度也造成侵染率差異[38]。合江方竹侵染率低可能是因?yàn)椴蓸訒r(shí)間為冬季，溫度低，且生長環(huán)境潮濕，也可能和調(diào)查地土壤中養(yǎng)分情況，尤其是含磷水平有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。雖然合江方竹自然狀態(tài)下侵染率不高，但是可以通過人為接種AM真菌菌種來提高其侵染率，如邢紅爽等[39]通過接種摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)和變形球囊霉(Glomusversiforme)提高了百合(Liliumbrowniivar.viridulum)的侵染率。因此，通過接種AM真菌在提高合江方竹產(chǎn)量、品質(zhì)、移栽苗成活率等應(yīng)用上仍然具有廣闊的前景。

GW1、GW2、GW1-L1、GW1-L2、GW2-L1、GW2-L2.發(fā)芽壁壁層；L1、L2、L3.孢子壁壁層；1-2.細(xì)凹無梗囊霉(Acaulosporascrobiculata)[12]；3-4.蜜色無梗囊霉(A.mellea)[13]；5-6.柯氏無梗囊霉(A.koskei)[9]；7-8.皺襞無梗囊霉(A.rugose)[14]19；9-10.波狀無梗囊霉(A.undulata)[15-16]；11-12.光壁無梗囊霉(A.laevis)[14]14；13-14.孔窩無梗囊霉(A.foveata)[17]；15-16.凹坑無梗囊霉(A.excavate)[14]11；17-18.疣狀無梗囊霉(A.tuberculata)[14]23-24；19-20.大型無梗囊霉(A.colossica)[14]7-8；21-22.光亮多樣孢囊霉(Diversisporaclara)[18]；23-24.美麗盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora)[19]；25-26.球狀巨孢囊霉(Gigasporamargarita)[20]；27-28.長孢球囊霉(Glomusdolichosporum)[21]；29-30.小果球囊霉(G.microcarpum)[14]70-71；31-32.刺球囊霉(G.spinosum)[22]；33-34.黃孢球囊霉(G.flavisporum)[23]；35-36.卷曲球囊霉(G.convolutum)[24]；37-38.大果球囊霉(G.macrocarpum)[23]；39-40.叉狀隔球囊霉(Septoglomusfurcatum)[25-26]；41-42.縮隔球囊霉(S.constrictum)[14]44-45；43-44.懸鉤子硬囊霉(Sclerocystisrubiforme)[27]；45-46.厚皮雙型囊霉(Ambisporacallosa)[28]；47-48.網(wǎng)紋雙型囊霉(A.reticulata)[16]。

圖2合江方竹根系A(chǔ)M真菌孢子形態(tài)

表1 合江方竹根系A(chǔ)M真菌多樣性指標(biāo)

合江方竹天然林分布地貴州省遵義市赤水市大同鎮(zhèn)方竹根際土壤中AM真菌孢子經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定確定其有8屬24種，其中無梗囊霉屬(Acaulospora)10種，多樣孢囊霉屬(Diversispora)1種，盾巨孢囊霉屬(Scutellospora)1種，巨孢囊霉屬(Gigaspora)1種，球囊霉屬(Glomus)6種，隔球囊霉屬(Septoglomus)2種，硬囊霉屬(Sclerocystis)1種，雙型囊霉屬(Ambispora)2種?？梢姡谧匀画h(huán)境中，合江方竹根系A(chǔ)M真菌種質(zhì)資源豐富。其中無梗囊霉屬和球囊霉屬的孢子種類和數(shù)量較多，與金佛山方竹[5]、紫背天葵(Begoniafimbristipula)[40]、半夏(Pinelliaternata)[41]、滑桃木(Trewianudiflora)[42]、廣西木薯(Manihotesculenta)[43]、廣西柳江生姜(Zingiberofficinale)[44]、牡丹(Paeoniasuffruticosa)主栽培根際根圍[45]和貴州茶樹(Camelliasinensis)[46]的AM真菌組成具有一定的相似性，說明無梗囊霉屬與球囊霉屬能適應(yīng)更多的環(huán)境，具有適應(yīng)性強(qiáng)、分布較廣泛的特點(diǎn)。本研究中的AM真菌物種多度與金佛山方竹相似，但屬的多樣性高于金佛山方竹，可能是合江方竹生存的環(huán)境更適合與AM真菌不同屬建立共生關(guān)系，也可能是合江方竹與AM真菌具有更好的親和性，具體原因有待進(jìn)一步研究。

AM真菌的多樣性受到環(huán)境因素影響，其對環(huán)境的適應(yīng)也具有選擇性，適應(yīng)生境的菌種大量繁殖并隨之成為優(yōu)勢種，相反則會被慢慢淘汰至消失在該類生境中[47]。本研究中的柯氏無梗囊霉(A.koskei)、小果球囊霉(G.microcarpum)、長孢球囊霉(G.dolichosporum)可能自身生物學(xué)的特性比較適應(yīng)該生境，在試驗(yàn)觀察過程中出現(xiàn)的頻度較高、重要值高，初步確定為該生境優(yōu)勢種，與金佛山方竹[5]、灌木鐵線蓮(Clematisfruticosa)[48]及梵凈山菝葜(Smilaxchina)、箭竹(Fargesiaspathacea)和銀葉杜鵑(Rhododendronargyrophyllum)等植物根際土壤叢枝菌根的研究結(jié)果[19]基本一致。

完善植物叢枝菌根真菌的種質(zhì)資源調(diào)查，對篩選高效菌種、菌根真菌資源在農(nóng)林業(yè)上的開發(fā)和應(yīng)用具有重要的意義，如英國洛桑農(nóng)業(yè)研究中心將生產(chǎn)的AM菌劑推廣到法國、丹麥和日本等國家，將其廣泛運(yùn)用在果樹、蔬菜及花卉上，提高了經(jīng)濟(jì)效益[49]。在生物技術(shù)上，通過接種叢枝菌根真菌，育成菌根化苗木可促進(jìn)幼苗生長[50-52]、提高植物的抗旱性[49]、提高植物耐受鹽堿脅迫能力[53]、增強(qiáng)對N、P等元素的吸收[54]能力。本研究在國內(nèi)首次對合江方竹根際中AM真菌的侵染狀況進(jìn)行了調(diào)查，并對根際AM真菌種類進(jìn)行了鑒定，確定了合江方竹部分AM真菌種質(zhì)資源，完善了貴州部分叢枝菌根真菌(AMF)菌種資源，為叢枝菌根的研究與應(yīng)用提供了資源；在生產(chǎn)上，可為菌劑篩選提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為合江方竹菌根化育苗、栽培和豐產(chǎn)提供依據(jù)。