李文文，劉書(shū)朋*，王中陽(yáng)

(1.上海大學(xué) 上海先進(jìn)通信與數(shù)據(jù)科學(xué)研究院 特種光纖與光接入網(wǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200444；2.中國(guó)科學(xué)院 上海高等研究院，上海 201210)

引 言

如今，光敏定位顯微鏡(photo-activated localization microscopy,PALM)[2]、隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)[3]和基于光學(xué)漲落信號(hào)的超分辨顯微技術(shù)(super-resolution optical fluctuation imaging,SOFI)[4]的出現(xiàn)真正打破了光學(xué)衍射極限，它們主要利用熒光分子自身固有性質(zhì)或光誘導(dǎo)來(lái)獲得熒光信號(hào)的隨機(jī)閃爍和漲落特性，從而實(shí)現(xiàn)單分子定位或關(guān)聯(lián)成像。在成像過(guò)程中，雖然是基于寬場(chǎng)顯微鏡，不需要采取掃描方式，但為了獲得熒光信號(hào)隨著時(shí)間光的閃爍和漲落信息，往往需要采集幾千到上萬(wàn)幀圖像來(lái)重構(gòu)一張超分辨圖像，這大大降低了成像速度,導(dǎo)致無(wú)法有效地對(duì)活細(xì)胞和動(dòng)態(tài)過(guò)程實(shí)現(xiàn)快速成像。為了縮短STORM的采樣幀數(shù)，HUANG課題組[5]提出將壓縮感知(compressed sensing,CS)與STORM結(jié)合的CS-STORM技術(shù)，利用凸優(yōu)化算法實(shí)現(xiàn)壓縮采樣，采樣幀數(shù)可以從幾萬(wàn)幀縮短到幾百幀。但由于算法的限制，得到一張超分辨圖像卻需要幾天的時(shí)間。ZHUANG課題組[6]在此基礎(chǔ)上提出壓縮感知最小l1范數(shù)(l1homotopy,L1H)算法來(lái)降低圖片處理時(shí)間。但壓縮感知在STORM上的應(yīng)用只起到了壓縮采樣的作用，并沒(méi)有充分利用其基于稀疏性的超分辨能力，并且CS-STORM獲得一張超分辨圖像任需要采集幾百幀，依然無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速動(dòng)態(tài)成像。因此，科學(xué)家們迫切需要一種能實(shí)現(xiàn)超分辨成像并能夠快速采樣的熒光顯微鏡。

壓縮感知理論[7]提供了一種新型信號(hào)重構(gòu)方法。它可以利用信號(hào)的稀疏性在低采樣率的情況下通過(guò)求解優(yōu)化問(wèn)題準(zhǔn)確重構(gòu)原始信號(hào)，并實(shí)現(xiàn)單幅超分辨成像。其超分辨能力已經(jīng)被CANDS等人嚴(yán)格地?cái)?shù)學(xué)證明[8]，并且該方法已經(jīng)有效地應(yīng)用在了雷達(dá)成像[9]、磁共振成像[10]、計(jì)算機(jī)斷層掃描成像(computed tomography,CT)[11]和鬼成像[12]等領(lǐng)域。本文中將壓縮感知應(yīng)用到熒光顯微鏡中，利用基于熒光標(biāo)記的樣品具有天然稀疏性這一特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)單幀寬場(chǎng)超分辨成像，且成像分辨率相比寬場(chǎng)提高1.8倍，采樣幀數(shù)縮短至單幀。該方法的優(yōu)勢(shì)在于不需要改變顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，不需要點(diǎn)掃描或多幀采樣，也不需要利用熒光染料的閃爍特性，可針對(duì)任何熒光樣品實(shí)現(xiàn)快速成像，這大大降低了設(shè)備搭建和樣品制作的難度。利用壓縮感知的投影梯度稀疏重構(gòu)算法(gradient projection for sparse reconstruction,GPSR)[13]對(duì)信號(hào)進(jìn)行分塊重構(gòu)，大大降低了數(shù)據(jù)存儲(chǔ)空間和計(jì)算時(shí)間，從而也降低了成像時(shí)間，在采樣速率和成像時(shí)間上都優(yōu)于現(xiàn)有的算法。本文中通過(guò)仿真分析該方法的單幀超分辨能力，以及采樣數(shù)對(duì)分辨率和稀疏度的影響，在搭建的全內(nèi)反射(total internal reflection fluorescence,TIRF)顯微成像系統(tǒng)上，通過(guò)實(shí)際的細(xì)胞成像來(lái)驗(yàn)證該方法的有效性。

1 壓縮感知成像理論和GPSR重構(gòu)算法

壓縮感知理論利用信號(hào)的稀疏性，用遠(yuǎn)低于Nyquist 采樣定理要求的采樣次數(shù)對(duì)信號(hào)進(jìn)行采樣或高噪聲和有損測(cè)量時(shí)，也能很好地恢復(fù)出原始信號(hào)。壓縮感知理論公式是:

min‖X‖0, (Y=AX)

(1)

式中,Y為采樣信號(hào)，是N×1的列向量，A是N×M的測(cè)量矩陣，X是M×1的原始信號(hào)。目標(biāo)信號(hào)的稀疏或變換后稀疏是壓縮感知的先決條件，在原始信號(hào)X中，有K?M個(gè)元素是非零的，其余大部分信號(hào)為零或近似為零，則稱(chēng)信號(hào)是K稀疏的。N是采樣數(shù)，它影響著壓縮感知恢復(fù)信號(hào)的能力[14]。

目前常用的壓縮感知重構(gòu)算法主要分為三大類(lèi)[15]：(1)貪婪方法。包括匹配追蹤(matching pursuit,MP)[16]、正交匹配追蹤(orthogonal matching pursuit,OMP)[17]等，其主要思想是通過(guò)迭代尋找匹配信號(hào)的最優(yōu)值;(2)松弛方法。它是基于l1范數(shù)的最小化，主要有GPSR、基追蹤算法(basis pursuit,BP)[18]，這一類(lèi)方法精度高、需要的測(cè)量個(gè)數(shù)少，但計(jì)算復(fù)雜度高;(3)非凸算法。該方法計(jì)算復(fù)雜度和精度都是介于以上兩種方法之間，典型的有迭代重加權(quán)重構(gòu)算法[19]。此外，還有軟、硬迭代閾值等[20]、貝葉斯壓縮感知重構(gòu)算法[21]等也是使用較多的壓縮感知重構(gòu)算法。

本文中采用GPSR算法來(lái)重構(gòu)原始圖像，由于(1)式中‖X‖0為非凸函數(shù)，無(wú)法求解，為獲得次優(yōu)解，將(1)式中對(duì)0范數(shù)的求解改寫(xiě)為求解次優(yōu)解，即:

min‖X‖1,(‖AX-Y‖2≤ε)

(2)

式中,ε是與噪聲有關(guān)的一個(gè)參量，根據(jù)參考文獻(xiàn)[22],可將(2)式轉(zhuǎn)化為下式:

(3)

式中,τ>0表示可自定義的正則化參量，對(duì)于(2)式，任意ε總有τ與其對(duì)應(yīng)，從而保證(2)式、(3)式有共同解。該算法由于ε的參與而具有一定的抗噪能力，因此利用(3)式求解的算法被稱(chēng)作基追蹤降噪算法。但是由于寬場(chǎng)顯微成像中測(cè)量矩陣的數(shù)據(jù)量大,導(dǎo)致 (3)式不能夠快速高效地求解出超分辨圖像，因此根據(jù)參考文獻(xiàn)[23],將(3)式進(jìn)行再次優(yōu)化，從而簡(jiǎn)化計(jì)算過(guò)程，降低計(jì)算時(shí)間。優(yōu)化算法采用GPSR-BB(Barzilai-Borwein)，這種算法計(jì)算復(fù)雜度低于基追蹤降噪的方式，對(duì)于有限等距約束的要求低于正交匹配追蹤算法。因此，能夠在測(cè)量矩陣數(shù)據(jù)大和噪聲干擾的情況下快速準(zhǔn)確地重構(gòu)出原始信號(hào)。

2 實(shí)驗(yàn)裝置

TIRF熒光顯微鏡系統(tǒng)原理和裝置圖如圖1所示。 系統(tǒng)基于Ⅸ83(Olympus)顯微鏡搭建，主要分為4個(gè)模塊：(1)激發(fā)光模塊。包括可見(jiàn)光波段下不同波長(zhǎng)的連續(xù)光和控制器，不同激光對(duì)應(yīng)不同的熒光染料;(2)光纖耦合與全內(nèi)反射模塊。全內(nèi)反射用于提高信噪比，防止樣品其它焦面的信號(hào)干擾;(3)成像、掃描、空間調(diào)制及探測(cè)整合系統(tǒng)模塊。探測(cè)模塊用科研級(jí)相機(jī)探測(cè)，具有高靈敏度和高采樣幀率;(4)時(shí)序機(jī)電控制模塊?？刂莆灰婆_(tái)和探測(cè)器的同步，用于漂移校正和點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(point spread function,PSF)擬合時(shí)多幀采集過(guò)程。

Fig.1 a—schematic diagram of the imaging system b—experimental setup of the system

3 仿真結(jié)果和分析

本文中通過(guò)仿真來(lái)分析該方法單幀的超分辨能力以及評(píng)價(jià)采樣數(shù)對(duì)成像分辨率和原始信號(hào)稀疏度的影響。在仿真之前，先要在搭建好的顯微鏡上通過(guò)定標(biāo)來(lái)構(gòu)建測(cè)量矩陣A，A矩陣中的列向量表示單個(gè)染料分子在樣品面上某一位置下的PSF圖像，通過(guò)收集單個(gè)染料分子在樣品面上不同位置的PSF圖像來(lái)構(gòu)建A121×4096矩陣，其中行數(shù)N=121,表示探測(cè)器的采樣數(shù)為11pixel×11pixel，列數(shù)M=4096，表示重構(gòu)的原始圖像X轉(zhuǎn)化為2維矩陣的大小為64pixel×64pixel。定標(biāo)過(guò)程是對(duì)探測(cè)到的單個(gè)染料分子的熒光信號(hào)進(jìn)行2維高斯擬合，獲得PSF，再根據(jù)函數(shù)生成染料分子在不同位置下熒光寬場(chǎng)圖像，從而構(gòu)建A矩陣[5]。通過(guò)探測(cè)單個(gè)染料分子的PSF半峰全寬(full width at half maxima,FWHM)可知，該系統(tǒng)的衍射極限，即系統(tǒng)的分辨率是330nm。獲得A矩陣后，通過(guò)仿真來(lái)驗(yàn)證該系統(tǒng)的超分辨能力。首先在X上生成兩個(gè)相距180nm的分子，如圖2a所示。通過(guò)與實(shí)驗(yàn)獲得的PSF卷積來(lái)模擬探測(cè)器上的衍射極限下寬場(chǎng)圖像Y，如圖2b所示，由于衍射極限的影響，這兩個(gè)分子無(wú)法分辨。通過(guò)壓縮感知GPSR-BB算法對(duì)Y進(jìn)行重構(gòu)，如圖2c所示，這兩個(gè)分子可以清楚的分辨。分別對(duì)寬場(chǎng)圖像和重構(gòu)圖像白線上的強(qiáng)度進(jìn)行擬合，如圖2d所示，點(diǎn)線表示原始圖像分子的分布，實(shí)線表示寬場(chǎng)圖像的強(qiáng)度分布，虛線表示重構(gòu)后的強(qiáng)度分布，根據(jù)瑞利判據(jù)可知，相比于衍射極限下的寬場(chǎng)圖像，利用壓縮感知可以實(shí)現(xiàn)超分辨成像，分辨率是180nm，相比衍射極限330nm提升了1.8倍。此外，還比較了不同采樣數(shù)(對(duì)探測(cè)器像素插值獲得)對(duì)分辨率的影響，圖2e～圖2h中是利用更低的采樣數(shù)構(gòu)建的測(cè)量矩陣A49×4096的重構(gòu)結(jié)果，可見(jiàn)采樣數(shù)降低導(dǎo)致分辨率減小，減小到200nm。

Fig.2 Imaging resolution and influence of sampling numbers on resolution

a—original image of two fluorescence molecules separated by 180nm b—wide-field image (160nm/pixel) of two fluorescence molecules separated by 180nm c—reconstruction results at sampling number 121 d—Gaussian fitting curve of intensity distribution on white line in Fig.2a～Fig.2c e—original image of two fluorescence molecules at a distance of 200nm f—wide-field images (160nm/pixel) of two fluorescence molecules at distance of 200nm g—reconstruction results at sampling number of 49 h—Gaussian fitting curve of intensity distribution on white line in Fig.2e～Fig.2g

Fig.3 Simulation results of high density images a—original image of ring with spacing of 180nm b—wide-field image (160nm/pixel) of ring c—reconstruction result of ring d—MSE curves under different sampling numbers and different sparsity

稀疏度表示在一定視場(chǎng)下標(biāo)記樣品的染料分子的個(gè)數(shù)，是影響壓縮感知重構(gòu)效果的關(guān)鍵因素，雖然熒光信號(hào)具有天然的稀疏性，但對(duì)于高密度標(biāo)記或密集結(jié)構(gòu)的生物樣品也會(huì)影響信號(hào)的重構(gòu)質(zhì)量。因此，需要了解稀疏度對(duì)成像分辨率和重構(gòu)質(zhì)量的影響。如圖3a～圖3c所示，在X上構(gòu)建180nm間距的圓環(huán)，實(shí)現(xiàn)高密度的重構(gòu)，重構(gòu)結(jié)果對(duì)比寬場(chǎng)圖像可知，在高密度下，依然能實(shí)現(xiàn)180nm的分辨率，可見(jiàn)密度的提高不會(huì)影響分辨率，此時(shí)提高的極限應(yīng)該是分辨率的倒數(shù)。稀疏度對(duì)重構(gòu)質(zhì)量的影響利用均方誤差(mean square error,MSE)eMSE=(1/M)∑‖X′-X‖2來(lái)評(píng)價(jià)，X′和X分別表示重構(gòu)圖像和原始圖像。為了判斷不同稀疏度對(duì)重構(gòu)質(zhì)量的影響，在X上生成不同數(shù)量的隨機(jī)分布的分子，通過(guò)PSF卷積獲得寬場(chǎng)圖像Y，再利用壓縮感知重構(gòu)得X′，比較X′和X在不同數(shù)量分子下均方誤差。如圖3d所示，均方誤差會(huì)隨著稀疏度的提高而緩慢的提高，表示重構(gòu)的質(zhì)量會(huì)逐漸變差。但是提高采樣數(shù)能夠降低均方誤差，提高重構(gòu)質(zhì)量。在相同的均方誤差下，利用A121×4096矩陣相比A49×4096能實(shí)現(xiàn)更高密度的重構(gòu)，重構(gòu)密度可以提高3倍。若要獲得更高密度的重構(gòu)，需要對(duì)信號(hào)進(jìn)行稀疏表征，通過(guò)變換獲得稀疏性。

Fig.4 Experimental results of microtubule

a,d—wide-field images b,e—reconstruction results c,f—Gaussian fitting curve of intensity distribution on white line in wide field images and reconstruction results

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了驗(yàn)證該方法的超分辨能力，本文實(shí)驗(yàn)中利用Alexa647染料分子標(biāo)記的固定細(xì)胞微管進(jìn)行成像，利用639nm激光來(lái)激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。成像視場(chǎng)是3.2μm×3.2μm，將視場(chǎng)分為6×6塊，每塊在A49×4096下用GPSR-BB進(jìn)行重構(gòu)，重構(gòu)結(jié)果去除塊與塊之間相互重合的邊緣區(qū)域后拼接，這是為了防止相鄰塊的信號(hào)的影響。實(shí)際探測(cè)到的寬場(chǎng)圖像如圖4a和圖4d所示，可見(jiàn)由于衍射極限的影響，無(wú)法分清細(xì)胞內(nèi)部微管的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)。經(jīng)過(guò)壓縮感知重構(gòu)后，如圖4b和圖4e所示，有一些寬場(chǎng)下無(wú)法分辨的結(jié)構(gòu)可以被清晰地分辨，如圖中白線所示。通過(guò)對(duì)白線上強(qiáng)度分布進(jìn)行擬合，如圖4c和圖4f所示，寬場(chǎng)圖像下的強(qiáng)度分布曲線(實(shí)線)顯示兩根微管無(wú)法分辨，而重構(gòu)后可以看到明顯的雙峰(虛線)，根據(jù)瑞利判據(jù)可知，兩根微管可以被清晰分辨。這說(shuō)明利用壓縮感知對(duì)顯微圖像重構(gòu)可以突破寬場(chǎng)的衍射極限，提高成像分辨率。并且采樣幀數(shù)降低到單幀，計(jì)算時(shí)間也只需要3s～5s，在同等視場(chǎng)下相比現(xiàn)有的超分辨熒光顯微成像方法都有數(shù)量級(jí)的提升。圖4中上行和下行表示不同密度下，該方法都能體現(xiàn)很好超分辨能力和重構(gòu)效果。

5 結(jié) 論

作者提出將壓縮感知應(yīng)用到超分辨熒光顯微成像中，利用稀疏性實(shí)現(xiàn)超分辨。通過(guò)仿真和實(shí)驗(yàn)證明了該方法不僅能夠突破光學(xué)衍射極限，成像分辨率相比傳統(tǒng)的顯微鏡提高了1.8倍，還可以實(shí)現(xiàn)單幀顯微成像，比現(xiàn)有的超分辨成像技術(shù)具有更快的采樣速度和更少的計(jì)算時(shí)間。該方法可以同時(shí)兼顧超分辨、快速成像和視場(chǎng)，還能應(yīng)用在任何熒光樣品上，并且激發(fā)功率低，可以降低顯微成像的光毒性，這些優(yōu)勢(shì)對(duì)生物學(xué)中觀察活細(xì)胞或動(dòng)態(tài)過(guò)程都具有重要的意義。為了進(jìn)一步提高成像分辨率，可以對(duì)測(cè)量矩陣優(yōu)化，降低它的互相關(guān)度，使它的有限等距性質(zhì)更好，更滿(mǎn)足壓縮感知的條件，最大限度利用稀疏度來(lái)提高分辨率。此外，還可以通過(guò)插值或?qū)π盘?hào)進(jìn)一步放大來(lái)提高探測(cè)器的采樣數(shù)，從而提高成像分辨率。