劉惠英，朱志強，陳嘉敏，羅美林，熊玉杰，易璐瑤，魏蜜

(1.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室，湖北 孝感 432000；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062)

0 引言

鳳梨(Ananascomosus)又名菠蘿，屬鳳梨科(Bromeliaceae)鳳梨屬(Ananas)多年生草本果樹植物，營養(yǎng)生長迅速，生產(chǎn)周期短，是世界重要的果樹之一.在我國華南沿海一帶分布廣泛.作為熱帶地區(qū)特色水果，葉片細(xì)長的單子葉植物.不僅具有觀賞價值，可作為室內(nèi)常綠觀賞花卉，還可以吸收污染物，從而作為空氣污染指示植物[1].內(nèi)生菌在植物中看起來微不足道，但內(nèi)生菌可通過自身代謝物或通過信號傳導(dǎo)對植物產(chǎn)生作用.有內(nèi)生菌存在的植物一般比無內(nèi)生菌植物生長迅速.一方面是：內(nèi)生菌可分泌IAA、吲哚乙酸、激動素等促生長激素；另一方面是：增強植物對營養(yǎng)元素氮、磷、鉀的吸收[2].在一株植物中，并非只有一種內(nèi)生菌，眾多的內(nèi)生菌協(xié)調(diào)的存在于宿主體內(nèi)，通過它們的共同作用，促進植物的生長[3].另外，內(nèi)生菌之間也相互制約，一種內(nèi)生菌可能會影響一種甚至多種內(nèi)生菌在宿主植物中的生存，進而達到微環(huán)境的動態(tài)平衡[4].

本課題以鳳梨為原料，對內(nèi)生菌進行篩選和鑒定，通過平板對峙培養(yǎng)法篩選出3株對蔬菜軟腐病菌菊迪基氏菌有拮抗效果的生防細(xì)菌，并通過形態(tài)學(xué)、生理生化和分子手段對其進行鑒定.評價了篩選的生防菌對常見細(xì)菌性病害和真菌病害的拮抗作用，并進一步評價了其解磷固氮和產(chǎn)纖維素酶能力，這對生防菌的選用及植物抗病促生提供了理論基礎(chǔ)及參考，為拓展生物防治的微生物資源奠定了一定的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試葉片 鳳梨葉片于2018年10月采自湖北省孝感市孝南區(qū)臥龍鄉(xiāng)鳳梨種植基地.

1.1.2 供試菌株 病原細(xì)菌：蔬菜軟腐病菌菊迪基氏菌DickeyachrysanthemiHBEU-9、胡蘿卜果膠桿菌PectobacteriumcarotovorumZX-1、丁香假單胞菌PseudomonassyringaeG1、黃單胞菌XanthomonasarboricolaDW3F3.

病原真菌：燕麥鐮孢菌FusariumavenaceumRot2、膠孢炭疽菌ColletotrichumgloeosporioidesPearE、互隔交鏈孢霉Alternariaalternatezzha.

以上所有菌株均由湖北工程學(xué)院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室提供.

1.1.3 主要培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基[5]：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，瓊脂18 g，加入蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.2；PDA培養(yǎng)基[5]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL；PD則不加瓊脂.

生理生化鑒定所需培養(yǎng)基：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6].

PVK培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母浸膏0.5 g，NaCl 0.2 g，Ca3(PO4)25 g，(NH4)2SO40.5 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 g，瓊脂粉18 g，0.4%溴酚藍(lán)(pH6.7)6 mL，加蒸餾水定容至1 000 mL；Asnby培養(yǎng)基：KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35 g，甘露醇10.0 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，瓊脂18 g，加蒸餾水定容至1 000 mL；纖維素酶培養(yǎng)基：CMC 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉10 g，NaCl 5 g，KH2PO41 g，瓊脂18 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0.

以上所有藥品試劑均購于生工生物工程(上海)股份有限公司，馬鈴薯則購于孝感當(dāng)?shù)爻?

1.2 方法

1.2.1 鳳梨拮抗內(nèi)生菌的分離與篩選 將鳳梨葉片洗凈涼干后于超凈工作臺上進行表面消毒處理[7]：70%乙醇中浸泡2～3 s后，用0.1% 酸性升汞水溶液處理1～3 min，再用無菌水清洗3次.

對表面已消毒的材料采用研磨法[6]分離內(nèi)生菌.所得研磨勻漿適當(dāng)稀釋，涂布于 LB、PDA平板上于28 ℃培養(yǎng)2～7 d.待長出菌落后采用培養(yǎng)皿稀釋培養(yǎng)法[7]和平板劃線分離法[7]進行內(nèi)生菌的分離純化，直到得到單菌落，然后將菌落形態(tài)特征不同的單菌落分別挑取并及時分離編號，4 ℃保存?zhèn)溆?

初篩：采用點接法[6]進行初步篩選.量取100 μLD.chrysanthemiHBEU-9病原細(xì)菌發(fā)酵液，在LB平板上進行涂布，待干燥后用接種針分別挑取各內(nèi)生菌點于平板上，每皿采用十字交叉法點接一種內(nèi)生菌，對照不接種，30 ℃下培養(yǎng)3～7 d，觀察有無抑菌圈及抑菌圈直徑，測量抑菌圈直徑.

復(fù)篩：采用發(fā)酵液打孔法[6]進行再次篩選.量取100 μLD.chrysanthemiHBEU-9病原細(xì)菌發(fā)酵液，在LB平板上進行涂布，待干燥后采用十字交叉法在平板上打4個對稱的4 mm小孔，每孔接種20 μL的內(nèi)生菌發(fā)酵液，對照不接種，30 ℃下培養(yǎng)3～7 d，觀察有無抑菌圈及抑菌圈直徑，測量抑菌圈的直徑.

1.2.2 鳳梨內(nèi)生菌的鑒定

1)形態(tài)學(xué)鑒定.菌落形態(tài)觀察[6]：將內(nèi)生菌發(fā)酵液稀釋涂布于LB平板上30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況、顏色和大小、性狀、邊緣、表面、透明度等.

革蘭氏染色[6]：參照Hucker修改法[5]對獲得的內(nèi)生菌進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察染色結(jié)果，判斷其為革蘭氏陽性或陰性菌.

2)分子生物學(xué)鑒定.參考左山等[8]的分子生物學(xué)實驗方法，進行內(nèi)生菌菌株DNA提取，使用引物F27(AGAGTTTGA-TCCTGGCTCAG)和R1492(TACGGCTACC-TTGTTACGACTT)進行PCR擴增.反應(yīng)條件為：在94 ℃變性4 min；94 ℃變性30 s；然后55 ℃進行退火30 s，72 ℃進行延伸1 min，一共34個循環(huán)；最后在72 ℃下進行延伸10 min.得到的產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送天一輝遠(yuǎn)有限公司測序，得到測序結(jié)果后在NCBI網(wǎng)站上經(jīng)過BLAST同源性比較，使用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.3 拮抗效果測定 內(nèi)生菌發(fā)酵液制備[7]：取1%接種量把內(nèi)生菌F-2、F-3-1、F-3-2分別接種于LB液體培養(yǎng)基，在180 r/min，30 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)12～18 h.

抑制病原細(xì)菌拮抗效果測定[9]：采用平板對峙法[5]，在無菌超凈工作臺上，取病原細(xì)菌D.chrysanthemiHBEU-9、P.syringaeG1、X.arboricolaDW3F3、P.carotovorumZX-1發(fā)酵液100 μL在LB平板上涂布，內(nèi)生菌接種方法參照對內(nèi)生菌的篩選實驗，對照不接種，30 ℃下培養(yǎng)3～7 d，每隔12 h觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，測量并記錄抑菌直徑.

抑制病原真菌拮抗效果測定[10]：采用平板對抗法[5]，在無菌超凈工作臺上，將病原菌F.avenaceumRot2、C.gloeosporioidesPearE、A.alternatezzha菌塊用打孔器接種于PDA培養(yǎng)基中央，內(nèi)生菌接種方法參照對病原細(xì)菌的拮抗實驗，對照不接種，28 ℃條件下培養(yǎng)3～7 d，測量各篩選的內(nèi)生菌菌落邊緣與病原真菌菌落邊緣的抑菌圈并記錄.

1.2.4 部分生化指標(biāo)鑒定 生理生化鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[11]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]進行.

溶磷能力測定：分別在PVK培養(yǎng)基上點接所得內(nèi)生菌，于30 ℃培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次，待出現(xiàn)解磷圈及時記錄.

固氮能力測定：分別在Asnby培養(yǎng)基上采用劃線法接種所得內(nèi)生菌，于30 ℃培養(yǎng)，每隔12 h觀察一次，記錄菌株的生長狀況.

產(chǎn)纖維素酶能力測定：分別于纖維素酶培養(yǎng)基上點接所得內(nèi)生菌，于30 ℃培養(yǎng)，每隔12 h觀察記錄平板上菌落的生長情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳梨拮抗內(nèi)生菌的分離與篩選將分離到的內(nèi)生菌進行拮抗效果篩選.根據(jù)所獲得的菌株與病原菌進行平板對峙分析，結(jié)果表明有3株內(nèi)生細(xì)菌對以上4種病原細(xì)菌和3種病原真菌均有一定的抑制效果，將其編號為F-2、F-3-1、F-3-2.但本實驗未篩選到對上述病原細(xì)菌和真菌有抑制效果的內(nèi)生真菌.

2.2 鳳梨內(nèi)生菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 如圖1所示，通過觀察發(fā)現(xiàn)3株內(nèi)生細(xì)菌菌體呈桿狀，F(xiàn)-2和F-3-2芽胞為橢圓形到柱狀，F(xiàn)-3-1芽胞呈橢圓狀.3株內(nèi)生菌幼齡菌落均為圓形，表面及邊緣較為光滑，均呈白色，培養(yǎng)24 h后菌落表面變得干燥且起皺，但邊緣仍保持光滑，菌落顏色也任然為白色.通過革蘭氏染色，顯微觀察3株菌均為紫色，故為3株內(nèi)生菌均為革蘭氏陽性菌.

圖1 各菌株菌落及顯微形態(tài)

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 3株內(nèi)生菌16S rDNA區(qū)域經(jīng)過PCR擴增產(chǎn)物，均獲得了1 445 bp左右的堿基序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中均能找到同源性很高的相似菌株序列.使用MEGA6.0對3株內(nèi)生菌進行同源性分析，同時構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.發(fā)現(xiàn)F-2與Bacillusamyloliquefaciensstrain 13(登錄號HM1070806.1)菌株序列相似度為95%(如圖2)，確定F-2菌株為解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens).F-3-1與Bacillusmegateriumstrain NBRC 15308(T)(登錄號MK424276.1)菌株序列相似度為97%(如圖3)，確定F-3-1菌株為巨大芽胞桿菌(B.megaterium).F-3-2與Bacillussubtilisstrain JCM 1465(登錄號MH145363.1)菌株序列相似度為94%(如圖4)，確定F-3-2菌株為枯草芽胞桿菌(B.subtilis).

圖3 內(nèi)生菌F-3-1基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 內(nèi)生菌F-3-2基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 拮抗效果測定3株目標(biāo)內(nèi)生菌與8株病原菌拮抗實驗表明，F(xiàn)-2對病原細(xì)菌D.chrysanthemiHBEU-9、P.syringaeG1、X.arboricolaDW3F3、P.carotovorumZX-1均有不錯的拮抗效果，尤其對P.syringaeG1的抑菌直徑達到28.83 mm，但是F-2對3株供試病原真菌均無明顯拮抗作用(如圖5，圖6)；F-3-1對病原真菌F.avenaceumRot2、C.gloeosporioidesPearE、A.alternatezzhazzha均有極強的抑制作用，抑菌率分別為：70.83%、91.67%、65.56%(如表1)，僅對病原細(xì)菌D.chrysanthemiHBEU-9、P.syringaeG1、X.arboricolaDW3F3有拮抗效果，抑菌直徑平均為13.25 mm左右(如圖6)；F-3-2對病原真菌的拮抗效果遠(yuǎn)不如F-3-1，且僅對C.gloeosporioidesPearE、A.alternatezzhazzha有抑制作用，抑菌率為31.67%、23.88%，其對病原細(xì)菌的拮抗效果強于F-3-1，對X.arboricolaDW3F3、P.carotovorumZX-1的抑菌直徑分別為20.70 mm、13.33 mm均高于F-2，而對D.chrysanthemiHBEU-9、P.syringaeG1的抑制效果則低于F-2(如表2).即F-3-1表現(xiàn)出對多種病原真菌極強的抑制效果，可以開發(fā)為真菌的生防菌.F-2與F-3-2對真菌抑制效果較差，但對多種病原細(xì)菌表現(xiàn)出拮抗效果.可見不同的菌株的抗菌譜存在顯著差異.在利用內(nèi)生菌進行生物防治時可以有針對性的使用一種或多種菌聯(lián)用來達到抗病害的效果.

表1 各菌株與不同病原真菌的抑菌率 %

表2 各菌株對病原細(xì)菌的抑菌直徑 mm

表中抑菌直徑小于5.00 mm的均記為0.00 mm

圖5 內(nèi)生菌 F-3-1對各病原真菌的拮抗效果

圖6 3株內(nèi)生菌對各病原細(xì)菌的拮抗效果

2.4 內(nèi)生菌部分促生能力測定

2.4.1 內(nèi)生菌解磷能力測定 分離的3株內(nèi)生菌點接于PVK平板上，觀察解磷圈.從圖7可知，F(xiàn)-2、F-3-1、F-3-2均具有解磷能力，且F-2的解磷能力強于后者.說明F-2從磷酸三鈣中釋放游離磷酸的能力更強，能更好地利用環(huán)境中的磷元素.

圖7 3株內(nèi)生菌在PVK培養(yǎng)基上的生長情況

2.4.2 內(nèi)生菌固氮能力測定 將所得的3株內(nèi)生菌接種在Asnby培養(yǎng)基(無氮)上，通過觀察其能否在無氮源的環(huán)境中生長，來測定其是否具有固氮能力.實驗結(jié)果如圖8所示，F(xiàn)-2無固氮能力，F(xiàn)-3-1、F-3-2均能在無氮源培養(yǎng)基上生長，說明其具有固氮能力.

圖8 3株內(nèi)生菌在Asnby培養(yǎng)基(無氮)上的生長情況

2.4.3 內(nèi)生菌產(chǎn)纖維素酶能力測定 在纖維素酶培養(yǎng)基上點接獲得的內(nèi)生菌，觀察透明圈，即可判斷3株內(nèi)生菌能否產(chǎn)生纖維素酶，實驗結(jié)果如圖9所示.3株內(nèi)生菌都能產(chǎn)生透明圈，F(xiàn)-2、F-3-1、F-3-2均可以生成纖維素酶，并能分解纖維素.但從透明圈的大小判斷F-2和F-3-2的纖維素酶活性高于F-3-1.

圖9 各菌株在纖維素酶培養(yǎng)基上的生長情況

3 結(jié)論與討論

本課題探究了鳳梨內(nèi)生菌對常見病原菌的生防效果，并從生理生化層面、形態(tài)學(xué)層面、分子生物學(xué)層面對所獲得3株內(nèi)生菌進行鑒定.通過細(xì)菌真菌篩選方法，從鳳梨中篩選出18株內(nèi)生菌，通過平板對峙最終得到3株優(yōu)良內(nèi)生菌，分子生物學(xué)鑒定3株菌分別為BacillusamyloliquefaciensF-2，BacillusmegateriumF-3-1，BacillussubtilisF-3-2.為了明確其生防效果，又進一步進行了抑菌直徑的觀察，發(fā)現(xiàn)F-2和F-3-2對常見病原細(xì)菌有不錯的拮抗效果抑菌直徑平均為10 mm以上，F(xiàn)-3-1對常見病原真菌有極強的拮抗效果，平均抑菌率為76 %.同時，為了探究內(nèi)生菌促進植物生長的特性，采用篩選培養(yǎng)基對3株內(nèi)生菌進行溶磷固氮及產(chǎn)酶分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3株菌解磷，產(chǎn)纖維素酶能力較好，F(xiàn)-3-1和F-3-2具有較好的固氮能力.

參考協(xié)同演化(co-evolution)理論，內(nèi)生菌中內(nèi)生真菌能與宿主植物建立更穩(wěn)定的長期共生關(guān)系，因而，內(nèi)生真菌資源的發(fā)掘利用有待探索[12].從防治鳳梨黑斑病出發(fā)，本實驗獲得了具有高效防治效果的3株內(nèi)生細(xì)菌不僅可以促進宿主植物抗病害能力，更能通過改善生長環(huán)境中的磷源促進植物生長.內(nèi)生菌區(qū)別于普通拮抗菌，具有更大的利用潛力.雖然對內(nèi)生菌的多個指標(biāo)進行了測定，但是缺乏對這3株芽胞桿菌的深層抗菌基因簇的研究，鑒定獲得的內(nèi)生菌為芽胞桿菌，我們查閱文獻發(fā)現(xiàn)，芽胞桿菌已發(fā)現(xiàn)的抑菌物質(zhì)包括：豐源素、伊枯草素等非核糖體途徑產(chǎn)生的脂肽類抗生素[13]，以及核糖體途徑產(chǎn)生的脂肽類如類羊毛硫抗生素等，脂肽類物質(zhì)是芽胞桿菌的主要抗菌物質(zhì)，其表現(xiàn)為較強的抗真菌和極弱的抗細(xì)菌效果[14]，另芽胞桿菌可分泌聚酮類物質(zhì)亦有抗菌作用，研究表明聚酮針對細(xì)菌有很強的抑制作用[15-16]，結(jié)合我們的內(nèi)生菌F-3-1主要拮抗病原真菌的特性，推測其抗菌活性和脂肽類物質(zhì)有關(guān)；F-2和F-3-2的拮抗細(xì)菌作用與聚酮類物質(zhì)有關(guān).因此對內(nèi)生菌的研究還有待深入，進一步明確其基因?qū)用婵咕鷻C理.