馬建國，高志明，靳雷

(南部戰(zhàn)區(qū)海軍第二醫(yī)院骨科，海南 三亞 570008)

骨質(zhì)疏松是以骨超微結(jié)構(gòu)改變、骨量丟失、骨質(zhì)脆性增加為特征的骨代謝性疾病，近年來隨著人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松的發(fā)生率也呈逐年升高的趨勢，相應(yīng)的骨折風(fēng)險也明顯增加[1]。成骨細(xì)胞所介導(dǎo)的骨形成過程在調(diào)節(jié)骨超微結(jié)構(gòu)、維持骨量中起到重要作用[2-3]。在間充質(zhì)干細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞分化及成骨細(xì)胞增殖的過程中，成熟的成骨細(xì)胞一方面大量分泌骨鈣素(osteocalcin，OCN)、I型膠原(Collagen-I，Col-Ⅰ)并參與骨基質(zhì)的形成，另一方面大量分泌堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)并參與骨礦化的過程，兩方面因素共同作用得以使骨組織維持完整的結(jié)構(gòu)[4-5]。在骨質(zhì)疏松的發(fā)生過程中，成骨細(xì)胞的分化及增殖均受到抑制，但目前調(diào)控成骨細(xì)胞分化和增殖的機(jī)制仍未完全明確。

微小RNA(microRNA，miR)是具有廣泛生物學(xué)作用的非編碼小分子RNA，雖然本身不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，但是與基因mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合后能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)并通過基因表達(dá)的變化來產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)活性。近年來關(guān)于miR與骨質(zhì)疏松的研究表明，多種miR與骨質(zhì)疏松的發(fā)生有關(guān)[6-7]，骨質(zhì)疏松過程中成骨細(xì)胞的分化、增殖受到與miR185、miR-214、miR-367等miR的調(diào)控[8-9]。其中miR-367是能夠靶向Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路的miR[10]，該通路在成骨細(xì)胞的分化及增殖中起到重要作用。基于此，本研究具體分析了MiR-367通過Wnt/β-catenin對成骨細(xì)胞分化及增殖的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計 細(xì)胞培養(yǎng)及分子生物學(xué)實驗。

1.2 實驗時間和地點 于2017年6月至2018年10月在醫(yī)院中心實驗室完成。

1.3 實驗材料 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)購自上海中科院細(xì)胞資源中心，新生24 h的SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物公司，細(xì)胞培養(yǎng)所用杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbeeeo’s modified eagle medium，DMEM)、α-低限量Eagle培養(yǎng)基(α-minimal essential medium，α-MEM)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶購自Gibco公司，地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、溴化噻唑藍(lán)四氮唑(thiazolyl blue tetrazolium bromide MTT)、茜素紅購自Sigma公司，Lipofectamine2000試劑購自Invitrogen公司，miR-367-3p模擬物(序列3’-AGUGGUAACGAUUUCACGUUAA-5’)、抑制物及陰性對照(negative control，NC)模擬物、抑制劑由上海吉瑪公司合成，β-catenin、Runt2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)、ALP、OCN、Col-Ⅰ的引物由上海生工公司合成，β-catenin、RUNX2、ALP、OCN、Col-Ⅰ的第一抗體購自Abcam公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 BMSCs的轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)分化 BMSCs復(fù)蘇后用含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)，細(xì)胞融合至90%后用0.25%的胰酶消化、傳代，取第3～5代細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)分化。用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000分別將miR-367模擬物、抑制物及NC模擬物、抑制劑轉(zhuǎn)染進(jìn)入BMSCs。轉(zhuǎn)染24 h后將培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)BMSCs向成骨分化，具體成骨培養(yǎng)基為含有0.1 μmol/L地塞米松、10mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、10%胎牛血清的α-MEM。

1.4.2 成骨細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及處理 取新生SD大鼠5只，無菌條件下解剖顱蓋骨后取出骨膜、結(jié)締組織，將組織剪成1 mm3的碎塊，用0.25%胰蛋白酶2 mL消化10 min、加入血清終止消化并收集消化液、離心后保留沉淀，加入0.1% Ⅱ型膠原酶繼續(xù)消化沉淀物100 min，加入血清終止消化后收集消化液、離心后得到細(xì)胞沉淀，重懸細(xì)胞后用200目濾網(wǎng)過濾并最終得到成骨細(xì)胞懸液；成骨細(xì)胞用含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)、用0.25胰酶傳代，取第3代成骨細(xì)胞并用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000分別轉(zhuǎn)染miR-367模擬物、抑制物及NC模擬物、抑制劑轉(zhuǎn)染，或聯(lián)合使用β-catenin抑制劑SKL2001(40 μmol/L)、β-catenin激動劑XAV939(40 μmol/L)，持續(xù)24 h。

1.4.3 成骨分化的茜素紅染色 BMSCs成骨誘導(dǎo)2～4周后，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)判斷成骨情況后，先用75%乙醇固定細(xì)胞30 min，蒸餾水沖洗3次后加入0.1%茜素紅(pH8.3)染色、37℃、30 min，染色后拍照記錄；加入10%氯化十六烷基吡啶500 μL、溶解骨結(jié)節(jié)后吸取50 μL液體，加入96孔板并在酶標(biāo)儀上測定570 nm處的吸光值(OD570)。

1.4.4 細(xì)胞增殖的MTT檢測 成骨細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中(每個條件設(shè)置5個復(fù)孔)，轉(zhuǎn)染miR-367或NC的模擬物、抑制物后24 h，向96孔培養(yǎng)板中加入MTT染色液10 μL，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，而后棄去培養(yǎng)孔內(nèi)的全部液體并加DMSO溶液150 μL，輕微震蕩培養(yǎng)板、使結(jié)晶充分溶解后在酶標(biāo)儀上測定490 nm處的吸光值(OD490)。

1.4.5 基因表達(dá)的熒光定量PCR檢測 成骨細(xì)胞不同條件干預(yù)后24 h，采用天根公司的試劑盒進(jìn)行檢測，首先細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒分離細(xì)胞內(nèi)的RNA，而后通過FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后采用Talent熒光定量檢測試劑盒配置反應(yīng)體系如下(每個條件設(shè)置3個復(fù)孔)：cDNA 1～2 μL、10 μmol/L的正向引物和反向引物各0.6 μL、試劑盒中的PCR反應(yīng)混合液10 μL、去離子水補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)程序如下：95℃ 5s、60℃ 15s，重復(fù)40個循環(huán)。在反應(yīng)曲線上讀取循環(huán)閾值(Ct)，以β-actin為內(nèi)參、參照公式2-ΔΔCt計算基因的mRNA表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 基因的引物序列

1.4.6 基因表達(dá)的western-blot檢測 成骨細(xì)胞不同條件干預(yù)后24 h，采用碧云天公司生成的蛋白裂解液提取細(xì)胞中的總蛋白，蛋白樣本加入預(yù)先配置好的SDS-聚丙烯酰胺凝膠的點樣槽內(nèi)，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、第一孵育抗體過夜、第二抗體孵育1 h的操作后，在NC膜上加入顯影液、在天能公司生成的顯影儀中顯影得到β-catenin、RUNX2、ALP、OCN、Col-Ⅰ的蛋白條帶，用Image J軟件計算蛋白條帶的灰度值，而后計算β-catenin/β-actin、RUNX2/β-actin、ALP/β-actin、OCN/β-actin、Col-Ⅰ/β-actin的比值，以此作為基因的蛋白表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 miR-367模擬物及抑制劑的轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染miR-367模擬物的細(xì)胞中miR-367的表達(dá)量為(2.25±0.52)，明顯高于轉(zhuǎn)染NC模擬物的細(xì)胞中miR-367的表達(dá)量(0.83±0.15)；轉(zhuǎn)染miR-367抑制劑的細(xì)胞中miR-367的表達(dá)量為(0.41±0.09)，明顯高于轉(zhuǎn)染NC抑制劑的細(xì)胞中miR-367的表達(dá)量(0.89±0.16)。

2.2 miR-367對BMSCs成骨分化的調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)染miR-367的模擬物后，茜素紅染色后的OD570值與轉(zhuǎn)染NC的模擬物比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)染miR-367的抑制劑后，茜素紅染色后的OD570值與轉(zhuǎn)染NC的抑制劑比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1～4。

2.3 miR-367對新生大鼠成骨細(xì)胞增殖活力的調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)染miR-367的模擬物后，細(xì)胞的MTTOD490值明顯低于轉(zhuǎn)染NC模擬物的細(xì)胞；轉(zhuǎn)染miR-367的抑制劑后，細(xì)胞的MTTOD490值明顯高于轉(zhuǎn)染NC抑制劑的細(xì)胞(P<0.05，見圖5～6)。

圖1 轉(zhuǎn)染NC及miR-367模擬物后的茜素紅染色圖 圖2 轉(zhuǎn)染NC及miR-367抑制物后的茜素紅染色圖

注：*與NC模擬物比較，P<0.05 注：*與NC抑制物比較，P<0.05

圖3 轉(zhuǎn)染NC及miR-367模擬物后的OD570值 圖4 轉(zhuǎn)染NC及miR-367抑制物后的OD570值 圖5 轉(zhuǎn)染NC及miR-367模擬物后的OD490值 圖6 轉(zhuǎn)染NC及miR-367抑制物后的的OD490值

2.4 miR-367對新生大鼠成骨細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的調(diào)節(jié) 轉(zhuǎn)染miR-367模擬物后，β-catenin的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平明顯低于轉(zhuǎn)染NC模擬物的細(xì)胞(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-367抑制物后，β-catenin的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)染NC抑制物的細(xì)胞(P<0.05)。見圖7～12。

2.5 miR-367通過Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)新生大鼠成骨細(xì)胞中成骨標(biāo)志基因的表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-367模擬物后，RUNX2、ALP、OCN、Col-Ⅰ的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平明顯低于轉(zhuǎn)染NC模擬物的細(xì)胞；轉(zhuǎn)染miR-367模擬物并聯(lián)合β-catenin激動劑SKL2001處理后，RUNX2、ALP、OCN、Col-Ⅰ的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)染miR-367模擬物的細(xì)胞(P<0.05)。見表2，見圖13～14。

轉(zhuǎn)染miR-367抑制物后，RUNX2、ALP、OCN、Col-Ⅰ的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)染NC抑制物的細(xì)胞；轉(zhuǎn)染miR-367抑制物并聯(lián)合β-catenin抑制劑XAV939處理后，RUNX2、ALP、OCN、Col-Ⅰ的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平明顯低于轉(zhuǎn)染miR-367抑制物的細(xì)胞(P<0.05)。見表3，見圖15～16。

3 討 論

骨質(zhì)疏松是好發(fā)于老年人、絕經(jīng)后女性的骨代謝性疾病，骨超微結(jié)構(gòu)的改變及骨骼脆性的增加會使骨折的風(fēng)險加大，需要積極進(jìn)行防治。成骨細(xì)胞介導(dǎo)骨形成過程和破骨細(xì)胞介導(dǎo)骨吸收過程的平衡在調(diào)節(jié)骨代謝、維持骨質(zhì)正常結(jié)構(gòu)中起到關(guān)鍵作用。成熟骨組織是含有豐富骨基質(zhì)且高度礦化的組裝，成骨細(xì)胞的分化成熟、增殖能夠分泌OCN、Col-Ⅰ等成分并直接參與骨基質(zhì)的形成，成骨細(xì)胞的礦化能夠維持骨骼的礦化[11-12]；當(dāng)成骨細(xì)胞的分化及增殖受到抑制時，骨基質(zhì)形成及礦化均會受到影響并參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生[13-14]。目前，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化、增殖及礦化的機(jī)制仍未完全闡明。

MiR是近年來受到越來越多關(guān)注的非編碼小分子RNA，靶向結(jié)合基因mRNA的3’非翻譯區(qū)、在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)后影響細(xì)胞的多種生物學(xué)行為、參與體內(nèi)多個組織臟器中的不同生物學(xué)過程。miR-367已被證實能夠靶向抑制信號通路Wnt/β-catenin[10]，而該信號通路被多項研究證實在成骨細(xì)胞分化、增殖中起到重要作用[15-16]。為了明確miR-367在成骨細(xì)胞分化、增殖及礦化中所起的作用，本研究分別培養(yǎng)了BMSCs和新生大鼠成骨細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染miR-367模擬物及抑制物的方式來增強(qiáng)或拮抗細(xì)胞內(nèi)miR-367的功能。在BMSCs中轉(zhuǎn)染miR-367的模擬物或抑制物后，茜素紅染色結(jié)果提示細(xì)胞的成骨分化過程未受到明顯影響，提示miR-367不直接影響B(tài)MSCs向成骨細(xì)胞分化過程。在新生大鼠成骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-367的模擬物或抑制物后，MTT檢測結(jié)果顯示miR-367的模擬物能夠使細(xì)胞增殖活力下降、而miR-367的抑制物能夠使細(xì)胞的增殖活力增強(qiáng)。由此提示miR-367在成骨細(xì)胞的增殖過程中起抑制作用。

注：*與NC模擬物比較，P<0.05 注：*與NC模擬物比較，P<0.05

注：*與NC抑制物比較，P<0.05 注：*與NC抑制物比較，P<0.05

圖10 轉(zhuǎn)染NC及miR-367抑制物后β-catenin的mRNA表達(dá)水平 圖11 轉(zhuǎn)染NC及miR-367抑制物后β-catenin的蛋白條帶 圖12 轉(zhuǎn)染NC及miR-367抑制物后β-catenin的蛋白表達(dá)水平

表2 轉(zhuǎn)染miR-367模擬物后成骨標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)

表3 轉(zhuǎn)染miR-367的抑制物后成骨標(biāo)志基因的mRNA表達(dá)

圖13 轉(zhuǎn)染miR-367模擬物后成骨標(biāo)志基因的蛋白條帶 圖15 轉(zhuǎn)染miR-367抑制物后成骨標(biāo)志基因的蛋白條帶

a RUNX2蛋白表達(dá) b OCN蛋白表達(dá) a RUNX2蛋白表達(dá) b OCN蛋白表達(dá)

c ALP蛋白表達(dá) d COL-1蛋白表達(dá) c ALP蛋白表達(dá) d COL-1蛋白表達(dá)

注：*與NC模擬物、轉(zhuǎn)染miR-367模擬物聯(lián)合SKL2001處理比較，均P<0.05 注：*與NC抑制物、轉(zhuǎn)染miR-367抑制物聯(lián)合XAV939處理比較，均P<0.05

圖14 轉(zhuǎn)染miR-367模擬物后成骨標(biāo)志基因的蛋白表達(dá)水平 圖16 轉(zhuǎn)染miR-367抑制物后成骨標(biāo)志基因的蛋白表達(dá)水平

Wnt/β-catenin通路在成骨細(xì)胞分化、增殖的過程中起到重要作用，β-catenin是該通路的核心分子。細(xì)胞內(nèi)由細(xì)胞支架蛋白(Axin)、糖原合成激酶3β(glycogen synthesis kinase 3β，GSK-3β)、結(jié)腸腺瘤樣息肉病基因(adenomatous polyposis coli，APC)組成的復(fù)合體能夠發(fā)揮對β-catenin的降解作用，進(jìn)而使Wnt/β-catenin通路處于失活或受抑制的狀態(tài)。當(dāng)Wnt發(fā)生活化時，Wnt與受體LRP5/6結(jié)合后能夠使Axin/β-catenin/APC復(fù)合體發(fā)生解離，進(jìn)而削弱了該復(fù)合體對β-catenin的降解作用，最終使β-catenin在細(xì)胞內(nèi)累積并逐步進(jìn)入細(xì)胞核、通過Tcf/Lef來調(diào)控下游多種靶基因的表達(dá)[17-18]。Target scan生物信息學(xué)分析顯示，β-catenin的mRNA 3’非翻譯區(qū)上有miR-367的結(jié)合位點，提示miR-367能夠靶向抑制β-catenin的表達(dá)。本研究在轉(zhuǎn)染miR-367的模擬物或抑制物后，觀察了成骨細(xì)胞中β-catenin表達(dá)的變化，結(jié)果如下：miR-367的模擬物能夠使成骨細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平降低、而miR-367的抑制物能夠使成骨細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)水平升高。這一結(jié)果表明miR-367能夠靶向抑制成骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的激活，這也可能是miR-367發(fā)揮成骨細(xì)胞增殖抑制作用的分子機(jī)制。

為了驗證Wnt/β-catenin通路在miR-367調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖中所起的作用及受其靶向調(diào)控的基因，本研究對多種成骨標(biāo)志基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。RUNX2的編碼產(chǎn)物是調(diào)控成骨細(xì)胞分化及增殖的轉(zhuǎn)錄因子，決定了成骨細(xì)胞的分化及增殖活力；ALP的編碼產(chǎn)物是參與骨基質(zhì)礦化的代謝酶，決定了骨礦化程度；OCN和Col-Ⅰ的編碼產(chǎn)物分別是骨基質(zhì)內(nèi)主要的非膠原成分和膠原成分，決定了骨基質(zhì)的含量。在轉(zhuǎn)染miR-367的模擬物和抑制物后，成骨細(xì)胞中上述成骨標(biāo)志基因的表達(dá)水平分別發(fā)生了下調(diào)和上調(diào)；在轉(zhuǎn)染miR-367模擬物的同時聯(lián)合使用β-catenin的激活劑能夠逆轉(zhuǎn)miR-367模擬物下調(diào)成骨標(biāo)志基因表達(dá)的效應(yīng)，而在轉(zhuǎn)染miR-367抑制物的同時聯(lián)合使用β-catenin的抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)miR-367抑制物上調(diào)成骨標(biāo)志基因表達(dá)的效應(yīng)。以上結(jié)果表明miR-367抑制成骨細(xì)胞增殖、抑制成骨標(biāo)志基因表達(dá)的效應(yīng)部分由Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)。

綜上所述，miR-367能夠抑制成骨細(xì)胞的增殖，但不影響成骨細(xì)胞的分化，同時也能抑制成骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的激活；今后可進(jìn)一步設(shè)計實驗、通過過表達(dá)β-catenin的方式來逆轉(zhuǎn)miR-367對成骨細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而驗證miR-367是否直接通過抑制Wnt/β-catenin通路來影響成骨細(xì)胞的增殖。