楊華，宣麗*，權(quán)志中，楊寧，梁麗萍，宗緒巖

（1.沈陽市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研發(fā)服務(wù)中心<沈陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院>，遼寧 沈陽 110025；2.沈陽市康普利德生物科技有限公司，遼寧 沈陽 110161；3.遼寧康普利德生物科技有限公司，遼寧 鐵嶺 112600；4.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000）

米糠是指糙米碾下的皮層，蛋白質(zhì)含量一般在12%～15%[1]。米糠粕是米糠經(jīng)浸出、脫脂處理后的產(chǎn)物，蛋白含量在15%以上，通過加熱膨化、浸取油脂處理可以在保留米糠營養(yǎng)特性、滅活抗?fàn)I養(yǎng)因子的同時延長保質(zhì)期[2]。因此，米糠粕更適合作為綜合開發(fā)利用的原料。高溫米糠粕是米糠經(jīng)過高溫提油之后的副產(chǎn)品。目前世界上每年生產(chǎn)米糠油50 萬t，中小企業(yè)生產(chǎn)米糠油時采用高溫提油工藝，而且米糠容易氧化酸敗，在4～6 h 內(nèi)必須進(jìn)行加工達(dá)到熱穩(wěn)定化，因此市面上大部分的米糠粕屬于高溫粕[3]。

米糠粕在熱穩(wěn)定化加工過程中蛋白質(zhì)容易發(fā)生變性，導(dǎo)致可溶性蛋白減少，給米糠蛋白的提取帶來困難。國內(nèi)外已有大量關(guān)于米糠深加工的研究報(bào)道[4]，例如從米糠中直接提取功能性物質(zhì)制備功能性食品、利用微生物發(fā)酵米糠實(shí)現(xiàn)其增值轉(zhuǎn)化，但鮮有關(guān)于高溫米糠粕綜合利用的研究。目前，米糠蛋白的提取方法主要有堿法、物理法、酶法以及物理法結(jié)合酶法[5]。其中，堿法提取是公認(rèn)的工藝簡便、提取率較高的一種方法[6]。超聲波提取法具有提取效率高、操作方便、溫度低、提取時間短等優(yōu)點(diǎn)[7]。酶法反應(yīng)條件溫和、蛋白提取得率較高，且能更多地保留蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值[5]。馬永強(qiáng)等[8]的研究表明，堿性蛋白酶對高溫米糠粕的水解效果較為突出；李東銳等[9]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波處理有助于米糠粕中米糠蛋白的提取，超聲功率的變化對米糠蛋白的提取率影響不大，而超聲處理時間影響相對較大，處理20 min 時蛋白提取率達(dá)到最大。

前期試驗(yàn)通過各活性物質(zhì)提取順序的研究，確定了適宜高溫米糠粕綜合利用的工藝順序，即提取植酸鈣→糖化酶除淀粉→提取蛋白質(zhì)→提取多糖。此工藝順序不僅最大程度避免了各活性物質(zhì)間的相互影響，而且提高了蛋白質(zhì)和多糖的質(zhì)量[10]。本試驗(yàn)以提取植酸鈣、除淀粉后的高溫米糠粕為原料，分別采用堿法、堿法-物理法（超聲波）、堿法-物理法-酶法（超聲波+堿性蛋白酶）三種方法提取蛋白質(zhì)，以期在相對溫和的反應(yīng)條件下優(yōu)化蛋白質(zhì)的提取工藝，從而為高溫米糠粕的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米糠粕：采購于沈陽金稻飼料有限公司。

硫酸銅、硫酸鉀、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑、硼酸、糖化酶、堿性蛋白酶（活力2.0×105U/g）、濃硫酸、濃鹽酸、碘、碘化鉀、氫氧化鈉等試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700 型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；HJ-M6 型水循環(huán)磁力攪拌水浴鍋，金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；STARTER 3100 型pH 計(jì)，上海奧豪斯儀器有限公司；CP 214 型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；K9860 型全自動凱氏定氮儀，海能儀器；SC-3614 型低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；101FA-0 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 米糠粕前處理

（1）提取植酸鈣

按照料液比1：10（g：mL），在室溫下提取1 h，提取溶劑為1 mol/L 鹽酸，對米糠粕進(jìn)行處理。提取結(jié)束后，離心，沉淀備用。

（2）糖化酶除淀粉

將1.3.1（1）中的沉淀，按照糖化酶添加量2%（糖化酶質(zhì)量/米糠粕原料質(zhì)量），料液比1：10（按米糠粕原料的質(zhì)量計(jì)），溫度60 ℃，pH 4.0～4.5，酶解4 h 進(jìn)行處理，滅酶，離心，沉淀備用。

1.3.2 米糠粕蛋白提取

（1）米糠粕蛋白堿法提取

1.3.1（2）中的沉淀→按照料液比1：10（按米糠粕原料的質(zhì)量計(jì)）加入蒸餾水→調(diào)節(jié)適當(dāng)pH→水浴溫度50 ℃，攪拌時間2 h→4 000 r/min 離心10 min，所得上清液處理方式分為步驟①②。

步驟①上清液用1 mol/L 鹽酸調(diào)pH 為3.6[8]→靜置過夜→10 000 r/min 離心10 min→取沉淀物→干燥。

步驟②沉淀物繼續(xù)在料液比為1：10 的水中、適當(dāng)?shù)膒H 值溫度50 ℃條件下，2 h 分別提取2 次、3 次→4 000 r/min 離心10 min →上清液處理方法同步驟①。

（2）米糠粕蛋白不同提取方法的比較

堿法：料液比1：10，pH 值為11，提取溫度50 ℃，提取時間4 h。

堿法+超聲波：料液比1：10，pH 值為11，超聲功率60 W，超聲時間20 min，超聲提取結(jié)束后，水浴提取溫度50℃，提取時間4 h。

堿法+超聲波+堿性蛋白酶：料液比1：10，pH 值為11，超聲功率60 W，超聲時間20 min，超聲提取結(jié)束后采用酶法提取，堿性蛋白酶添加量2.5%，提取溫度50 ℃，提取時間4 h。

提取結(jié)束后，滅酶，離心，上清液用1 mol/L 的鹽酸調(diào)整pH 為3.6，靜置過夜，沉淀離心后干燥，即得蛋白質(zhì)樣品。

1.3.3 堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白的單因素試驗(yàn)

在研究中發(fā)現(xiàn)，米糠粕具有較強(qiáng)的pH 緩沖作用，另外隨著酶解作用的進(jìn)行，樣品pH 值也會發(fā)生變化，所以本試驗(yàn)以酶解反應(yīng)結(jié)束后，蛋白提取液的pH 值作為監(jiān)測指標(biāo)，研究不同酶解工藝對米糠蛋白提取效果的影響。

（1）堿性蛋白酶添加量對米糠蛋白得率的影響

精確稱取50.0 g 米糠粕若干份，首先按照1.3.1 項(xiàng)進(jìn)行前處理，離心后的沉淀分別加入500 mL 蒸餾水，用10%氫氧化鈉調(diào)樣品pH 值為11，超聲功率60 W，超聲時間20 min，超聲提取結(jié)束后進(jìn)行酶法提取，堿性蛋白酶添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，溫度50 ℃，提取時間3 h。提取結(jié)束后，滅酶，離心，上清液測定pH 值，然后用1 mol/L 鹽酸調(diào)pH 為3.6，靜置過夜，沉淀離心后干燥，即得蛋白質(zhì)樣品，然后計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

（2）堿性蛋白酶酶解時間對米糠蛋白得率的影響

堿性蛋白酶添加量為1.5%，溫度50 ℃，提取時間分別為1、2、3 h。采用堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白，即得蛋白質(zhì)樣品，然后計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

（3）酶解結(jié)束后pH 值對米糠蛋白得率的影響

精確稱取50.0 g 米糠粕若干份，首先按照1.3.1 項(xiàng)進(jìn)行前處理，離心后的沉淀分別加入500 mL 蒸餾水，樣品pH 值在堿性范圍內(nèi)呈現(xiàn)梯度，以保證酶解后pH 值分別為7.5、8.5、9.5、10.5、11.5，超聲功率60 W，超聲時間20 min，超聲提取結(jié)束后酶法提取，堿性蛋白酶添加量1.5%，提取溫度50 ℃，提取時間1 h。提取結(jié)束后，滅酶，離心，上清液測定pH 值，然后用1 mol/L 鹽酸調(diào)pH 為3.6，靜置過夜，沉淀離心后干燥，即得蛋白質(zhì)樣品，然后計(jì)算蛋白質(zhì)得率。

1.3.4 堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factor and level table of orthogonal test

1.3.5 米糠蛋白的測定方法

采用GB5009.5《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法測定米糠蛋白樣品中蛋白質(zhì)的含量。按照公式（1）計(jì)算蛋白質(zhì)得率，按照公式（2）計(jì)算蛋白提取率。

表2 pH 和提取次數(shù)對米糠蛋白得率的影響Table 2 The effect of pH and extraction time on the yield of rice bran protein

式中：m1為蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量，g；m2為原料質(zhì)量，g。

式中：m3為米糠蛋白樣品得率，%；m4為米糠蛋白樣品的蛋白含量，%。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析及處理

使用IBM SPSS Statistics 20 軟件分析和處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠粕蛋白堿法提取

由表2 可以看出，pH 對米糠蛋白提取有較大影響。pH 值為8 時，第1 次提取，得率僅為0.12%；pH 值為9時，第1 次提取，得率提高到0.58%；pH 值為10 時，第1次提取，得率提高到1.28%，超過了pH 值為8 時3 次提取的蛋白得率總和；pH 值為11 時第1 次提取，得率提高到1.83%，超過了pH 值為9 時3 次提取的蛋白得率總和。因此后續(xù)試驗(yàn)選擇pH 值為11。

可見，通過增加提取次數(shù)和調(diào)整pH 值，也僅使米糠蛋白的得率從0.12%提高到2.90%，考慮到增加提取次數(shù)會大量增加生產(chǎn)成本，降低提取效率，而且對于經(jīng)熱穩(wěn)定化浸提米糠油的糠粕，堿法的提取效率也會大打折扣[11]，所以對高溫米糠粕進(jìn)行不同提取技術(shù)的復(fù)合處理很有必要。

2.2 米糠粕蛋白不同提取方法的比較

由表3 可以看出，超聲波輔助堿法提取較堿法提取，蛋白得率提高了0.22%，堿法+超聲波+堿性蛋白酶較堿法提取，蛋白得率提高了2.00%。雖然堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取的蛋白含量有所下降，但蛋白提取率還是高于堿法0.61%、高于堿法+超聲波法0.48%。故高溫米糠粕綜合利用研究中，蛋白質(zhì)的提取方法選擇堿法+超聲波+堿性蛋白酶法。

表3 不同提取方法對米糠蛋白提取效果的影響Table 3 The effect of extraction methods on the yield of rice bran protein

2.3 堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白的單因素試驗(yàn)

2.3.1 堿性蛋白酶添加量對米糠蛋白得率的影響

由圖1 可以看出，蛋白得率一方面和堿性蛋白酶的添加量有關(guān)，另一方面和酶解反應(yīng)結(jié)束后的pH 值有關(guān)。酶解反應(yīng)結(jié)束后的pH 值越低，蛋白得率相對越低，當(dāng)堿性蛋白酶添加量分別為1.0%、1.5%、2.0%時，蛋白得率相對較高，因此，選擇這三個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.3.2 堿性蛋白酶酶解時間對米糠蛋白得率的影響

由圖2 可以看出，隨著酶解時間的延長，蛋白得率先升高后下降，在酶解時間為2 h 時，蛋白得率最高，為4.31%，而酶解后pH 值隨著酶解時間的延長呈現(xiàn)下降趨勢，因此，選擇堿性蛋白酶的最佳酶解時間為2 h。

2.3.3 酶解結(jié)束后pH 值對米糠蛋白得率的影響

圖3 顯示了酶解結(jié)束后不同pH 值對米糠蛋白得率和含量的影響。由圖3 可以看出，酶解反應(yīng)結(jié)束后，蛋白提取液的pH 值越高，蛋白得率越高，蛋白含量也越高。隨著pH 值從7.5 增加到11.5，蛋白得率從2.56%提高到6.16%，蛋白含量從57.5%提高到70.0%。雖然隨著酶解后pH 的增加，蛋白得率一直呈現(xiàn)上升趨勢，但堿液濃度過高，蛋白質(zhì)中賴氨酸與丙氨酸、胱氨酸易發(fā)生縮合反應(yīng)，生成有毒化合物，使賴氨酸營養(yǎng)價(jià)值大幅降低[5]。為了兼顧蛋白得率和營養(yǎng)，選擇酶解后pH 值10.5、11.0、11.5 這三個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4 堿法+超聲波+堿性蛋白酶提取米糠蛋白正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5。

從表4、5 中的數(shù)據(jù)分析可知，三個因素均是影響米糠蛋白得率的極顯著因素，影響順序依次為酶解時間>蛋白酶添加量>酶解后pH 值；提取米糠蛋白的最佳條件是A2B1C2，即蛋白酶添加量1.5%、酶解時間1 h、酶解后pH 值11.0。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，該條件下得到的米糠蛋白得率為7.10%，高于其他試驗(yàn)組；此時蛋白含量為70.5%。本試驗(yàn)通過工藝優(yōu)化，使米糠蛋白在獲得高得率的同時保證了較高的蛋白含量。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal test

表5 正交試驗(yàn)方差分析Table 5 The variance analysis of orthogonal test

3 討論

高溫米糠粕中的可溶性蛋白比例較低，其氮溶解指數(shù)（Nitrogen soluble index，NSI）僅為11.6%，屬高變性蛋白[12]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)米糠蛋白未優(yōu)化提取條件之前，得率僅為0.12%，這限制了其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。本文通過優(yōu)化堿法+超聲波+堿性蛋白酶的提取工藝，確定了高溫米糠粕綜合利用工藝中米糠蛋白的最優(yōu)提取條件為堿性蛋白酶添加量1.5%、酶解時間1 h、酶解后pH 值11.0。三個因素均是影響米糠蛋白得率的極顯著因素，影響順序依次為酶解時間>蛋白酶添加量>酶解后pH 值。在此條件下，米糠蛋白得率為7.10%，蛋白含量為70.5%。

王丕新[13]通過考察歐美幾個稻谷加工廠，以及日本、韓國等發(fā)達(dá)國家米糠蛋白制取的先進(jìn)工藝，也整理出工業(yè)化米糠蛋白制取的工藝為兩次堿液浸出，他提出，未來有望在米糠蛋白制取工藝方面，結(jié)合酶法和高溫噴射蒸煮等更先進(jìn)的技術(shù)方法來實(shí)現(xiàn)米糠蛋白的全面工業(yè)化制取。他還指出，工業(yè)化生產(chǎn)米糠蛋白的原料為低溫脫脂米糠，限制了高溫米糠粕的應(yīng)用。本文的研究證實(shí)了堿法+超聲波+堿性蛋白酶法提高高溫米糠粕蛋白提取率的可行性。有研究表明，熱穩(wěn)定米糠粕蛋白經(jīng)堿性蛋白酶酶解后，蛋白的溶解度、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和泡沫穩(wěn)定性均有所提高[14]。在此基礎(chǔ)上，下一步需要確定不同提取工藝對米糠蛋白功能性的影響，從而為米糠蛋白的應(yīng)用提供理論依據(jù)。