周玉忠，王忠全，夏世龍，李彥輝，梁文星

（1.青島優(yōu)百粒種子處理設(shè)備有限公司，山東萊西 266600；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266000）

種子在經(jīng)濟(jì)學(xué)和生物學(xué)上的意義是顯而易見的，這是因?yàn)榉N子常被用作食物的來源并具有其他一些重要用途，如為工業(yè)化學(xué)品和其他產(chǎn)品的制造提供資源[1]。種子的健康和活力在確保農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量方面起著重要作用。在影響種子健康的各種因素中，病毒病是最大的影響因素之一，不僅會降低產(chǎn)量[2]和發(fā)芽率，而且還可以改變種子的形狀、顏色及化學(xué)組成。種子不能簡單地用化學(xué)藥品處理，種植戶也往往不了解有效的處理方法，因此近年來，由種子病毒病導(dǎo)致的作物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降越來越嚴(yán)重[3]。

病毒控制最有效的方法是使用脫毒種子。迄今為止，研究主要集中在通過使用各種化學(xué)物質(zhì)、熱療法、臭氧和存儲方式來滅活蔬菜種子中的病毒。Córdoba-Sellés 等[4]研究得出，將種子在10%磷酸三鈉中浸泡3 h，可以使黃瓜綠斑駁花葉病毒充分失活。Rast A 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，種子收獲3 個月后，在76 ℃的烤箱中干熱處理72 h，可消除整個辣椒花葉病毒種群，但對發(fā)芽不利。

目前研究人員已經(jīng)認(rèn)識到種子是病毒傳播中的主要傳染源之一。但尚需進(jìn)一步根據(jù)不同品種種子與其攜帶的多樣性病毒種類來確定消毒處理的最佳藥劑、使用劑量和治療持續(xù)時間，同時又不降低種子質(zhì)量。本試驗(yàn)研究了常見的化學(xué)和物理方法在清除番茄中的番茄花葉煙草花葉病毒（ToMV），番茄和辣椒中的煙草花葉病毒（TMV），辣椒、甜瓜和南瓜中黃瓜花葉病毒（CMV）的效率，探索了種子消毒的最佳處理方式。

1 材料和方法

1.1 種子材料來源和病毒檢測

215 個樣品從不同的種子公司獲得，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測定，確定了6 種高感病樣品被用作試驗(yàn)材料，分別為感染TMV 的番茄種子、感染ToMV 的番茄種子、感染CMV 的辣椒種子和感染TMV 的辣椒種子、感染CMV 的甜瓜種子、感染CMV 的南瓜種子。

1.2 病毒滅活處理

試驗(yàn)設(shè)計7 個病毒滅活處理，每個處理每種樣品選擇300 粒種子、重復(fù)3 次。根據(jù)ISTA[6]抽樣標(biāo)準(zhǔn)，從每種高病毒感染率的種子中選擇300×7×3=6 300 粒種子進(jìn)行病毒滅活處理。病毒滅活處理后，立即進(jìn)行洗滌、干燥并置于無菌培養(yǎng)皿中，測定相應(yīng)的指標(biāo)。

病毒滅活處理如下：（1）臭氧熏蒸處理：10 g/m3臭氧熏蒸10 min；（2）乙酸浸泡：在0.8%的乙酸（CH3COOH）中浸泡20 min；（3）過氧化氫浸泡：浸入4%過氧化氫（H2O2）溶液中浸泡20 min；（4）鹽酸浸泡：在2%鹽酸（HCl）中浸泡30 min；（5）次氯酸鈉浸泡：在0.4%的次氯酸鈉（NaClO）中浸泡30 min；（6）干熱處理：使用干熱處理設(shè)備在80 ℃下將種子加熱24 h；（7）溫湯浸種：將種子浸入65 ℃的熱水中浸泡25 min。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 消毒效果

上述處理后用單克隆抗體法[7]對種子進(jìn)行ELISA 測試，用酶標(biāo)儀在405 nm 波長下測定吸光度值（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中病毒的濃度，以評估種子處理效果。消毒效果計算公式見式（1）。

式中，A-對照種子的吸光度值；B-處理種子的吸光度值。

1.3.2 發(fā)芽率

根據(jù)ISTA 規(guī)則[6]在培養(yǎng)皿中的兩層濾紙上進(jìn)行發(fā)芽測試。將種子（每次處理25 個）放在平板中，并在室溫（20 ℃）下培養(yǎng)至胚根長到2 mm 長。發(fā)芽率計算公式見式（2）。

1.4 統(tǒng)計分析

利用SPSS13 軟件中的單方差分析模型對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用SNK 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種子處理方法對種子發(fā)芽率的影響

表1 不同種子處理方法對不同作物種子發(fā)芽率的影響Table 1 Effects of different seed treatments on seed germination rate

不同種子處理方法對不同作物種子發(fā)芽率的影響見表1。經(jīng)發(fā)芽率檢測結(jié)果顯示，不同處理對種子質(zhì)量無顯著影響，種子發(fā)芽率均在96%以上。

2.2 不同種子處理方法對種子的消毒效果

不同種子處理方法對作物種子病毒的消毒效果見表2。由表2 可知，7 種供試方法的消毒效果中最高為71.7%，這說明沒有一種處理能夠完全消除種子中的病毒，且不同處理方法病毒濃度的降低幅度不同。

2.2.1 HCl 處理對種子的消毒效果

HCl 可使病毒蛋白凝固并損害酶系統(tǒng)或改變膜通透性，從而引起寄生在種子種皮或內(nèi)表皮的病毒死亡。由表2 可知，HCl 處理是最有效的處理方法，導(dǎo)致番茄ToMV、番茄TMV、辣椒CMV、甜瓜CMV、南瓜CMV 發(fā)生率分別降低了71.7%、84.7%、62.7%、65.1%、64%。相比于其他處理方法，這種方法對辣椒中的TMV 的消除效果為中等，消除率為17.9%。

2.2.2 臭氧處理對種子的消毒效果

臭氧是一種強(qiáng)氧化劑，可直接與種子攜帶的病毒發(fā)生作用，破壞病毒細(xì)胞、核糖核酸（RNA），分解脫氧核糖核酸（DNA）、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)類和多糖等大分子聚合物，使病毒的代謝和繁殖過程遭到破壞，從而滅活種傳病毒。由表2 可知，臭氧處理的種子根據(jù)病毒和種子的不同，病毒濃度降低幅度在0.6%～55.7%之間，變化很大。從對上述幾種種傳病毒的消毒效果看，臭氧處理對被ToMV 感染的番茄種子最有效。

2.2.3 CH3COOH、H2O2、NaClO 對種子的消毒效果

CH3COOH、H2O2、NaClO 均為強(qiáng)氧化劑，殺菌原理與臭氧相同。CH3COOH 處理對病毒的滅活比率影響很小，對南瓜CMV 病毒消毒效果為4%，對番茄ToMV 消毒效果為8%。用H2O2、NaClO 處理種子，在整個病毒種子組合中獲得幾乎相同的結(jié)果。用H2O2、NaClO 處理感染ToMV 的番茄種子分別減少了42.3%、37.3%?？梢?，經(jīng)TMV 感染的番茄種子病毒消毒處理效果在5.8%～9.2%的范圍內(nèi)略有減少，在CMV 感染的辣椒種子消毒處理效果在3.8%～17.5%的范圍內(nèi)略有減少。

2.2.4 干熱處理、溫湯浸種對種子的消毒效果

干熱處理種子是在保障種子活力的條件下，依據(jù)不同作物種子的溫濕度耐受值，使種子在穩(wěn)定的高溫低濕環(huán)境中達(dá)到病原菌的致死溫濕度，殺滅病原菌。由表2 可知，在整個病毒種子處理組合中，干熱處理對辣椒CMV的消毒效果不好，而對其他病毒的消毒效果都較好，且對種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢無傷害。在65 ℃的熱水中加熱25 min 的溫湯浸種也顯示出良好的消毒效果，除對番茄TMV、辣椒TMV 的消毒效果不佳，對其他病毒的消毒效果都很好。

3 討論

目前我國農(nóng)民使用的種子大多是未經(jīng)認(rèn)證的種子，很容易在生產(chǎn)階段引入新的病害。因此，建議使用經(jīng)過病毒測試的種子來降低種子傳播病毒的發(fā)生率，并且進(jìn)行相應(yīng)的發(fā)芽測試。因?yàn)榧词乖谙嗤氖卟宋锓N中，種子批次的敏感性也有所不同，目前缺乏針對每種類型的種子或病毒物種的標(biāo)準(zhǔn)處理方法。因此，本試驗(yàn)研究了不同蔬菜種子中的各種病毒，以尋求控制種子病毒傳播的最有效、最可靠的方法。

試驗(yàn)結(jié)果表明，沒有一種處理能夠完全消除種子中的病毒病。Agarwal 等[8]認(rèn)為大多數(shù)種子傳播的病毒都出現(xiàn)在胚內(nèi)。Broadbent L[9]在番茄種子的胚珠和胚乳中發(fā)現(xiàn)了ToMV。ToMV 主要通過番茄種子的種皮和胚乳傳播，不通過胚[10]，但在辣椒種子中則主要通過種皮傳播，很少通過胚乳或胚芽[11]。CMV 存在于辣椒、甜瓜和西葫蘆種子的胚、胚乳和胚珠中[12]。

物理方法或溫湯浸種處理是基于對病原菌的致死溫度而殺死種子表面及內(nèi)部病原微生物的原理來防止感染的，這是降低種子傳播病毒水平的最古老的方法之一，在化學(xué)品防治未普及時，它確實(shí)很流行[13]。在這項研究中，分析了溫水（65 ℃下25 min），干熱（80 ℃下24 h）的功效。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比于其他處理方法，熱水和干熱處理均能有效地消滅病毒，但是，溫湯浸種操作過程中水溫不容易控制，很容易造成出芽率降低。

CH3COOH、HCl、NaClO 和H2O2是廉價且環(huán)保的化學(xué)藥品，具有潛在的、廣泛的應(yīng)用范圍，尤其是在禁止常規(guī)殺蟲劑的種子處理或其他消毒處理中，例如有機(jī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，除了被TMV 感染的辣椒種子外，在滅活病毒方面，發(fā)現(xiàn)HCl 比CH3COOH、NaClO和H2O2更有效，此外，HCl 對發(fā)芽沒有負(fù)面影響。Broadbent[10]也獲得了類似的結(jié)果。通常，CH3COOH、NaClO和H2O2處理無法有效清除種子中的病毒，這些結(jié)果與Anderson[14]獲得的結(jié)果不一致。

天然存在于地球大氣中的臭氧氣體被用作消毒劑已有100 多年的歷史了，美國環(huán)保署報告說，臭氧通過氧化衣殼蛋白來影響病毒。Finch 等[15]證明了含臭氧的水在殺死植物病原性真菌和病毒方面的成功，在這項研究中，對各種持續(xù)時間和劑量的臭氧的滅菌效果進(jìn)行了評估，以揭示其控制種子傳播病毒的功效。試驗(yàn)表明用臭氧處理可以有效降低種子中的病毒濃度，尤其是在以5 g/m3的濃度處理1 h 和以10 g/m3的濃度處理10 min 而又不妨礙發(fā)芽時，這和Runia[16]的試驗(yàn)結(jié)果一致。

Johansen 等[17]提出約18%～20%的植物病毒是種子傳播的。病毒感染的種子通常會引起原發(fā)性感染，種子流通通過跨區(qū)域運(yùn)輸越來越頻繁，病害發(fā)生風(fēng)險逐年增高，這可能會導(dǎo)致產(chǎn)量和質(zhì)量的巨大損失。因此，實(shí)現(xiàn)種子健康問題和尋找控制種子病毒傳播的方法非常重要。在本試驗(yàn)中，與其他處理相比，用HCl、干熱、溫湯浸種和臭氧處理對減少蔬菜種子的病毒感染更為有效。H2O2、CH3COOH 似乎無法成功滅活種子中的病毒。然而，HCl（2%持續(xù)30 min）、干熱（80 ℃持續(xù)24 h）和臭氧（10 g/m3持續(xù)10 min）對種子的病毒滅活效果好，而不會阻礙種子發(fā)芽，但下一步還需研究具體劑量和能持續(xù)的時間，否則細(xì)微差異也會導(dǎo)致種子損傷或無法消除病毒。