賽福丁·柯尤木 布力布·吉力斯?jié)h 馬蘭英 李娜 阿布拉江·塔依爾 劉翠云 舍玲 唐勇

摘 要 目的：探討絲裂原激活蛋白激酶激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MEK/ERK）通路特異性抑制劑PD98059聯(lián)合紫杉醇對(duì)人胃印戒細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法：以人胃印戒細(xì)胞癌KATOⅢ細(xì)胞為對(duì)象，采用CCK-8法檢測(cè)紫杉醇、PD98059以及兩藥聯(lián)合作用48 h后的細(xì)胞增殖情況，并計(jì)算增殖抑制率;采用流式細(xì)胞術(shù)、Western blotting、Transwell法分別檢測(cè)紫杉醇、PD98059以及兩藥聯(lián)合作用48 h或24 h后的細(xì)胞凋亡、凋亡相關(guān)蛋白[分裂型胱天蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）]表達(dá)和細(xì)胞遷移情況。結(jié)果：經(jīng)紫杉醇（1 μg/mL）、PD98059（5、20、40 μmol/L）以及兩藥（1 μg/mL+5、20、40 μmol/L）聯(lián)合作用后，各給藥組細(xì)胞的增殖抑制率均顯著升高，且聯(lián)用組顯著高于紫杉醇、PD98059同劑量單用組（P<0.05）。經(jīng)紫杉醇（1 μg/mL）、PD98059（40 μmol/L）以及兩藥（1 μg/mL+40 μmol/L）聯(lián)合作用后，紫杉醇組和兩藥聯(lián)用組細(xì)胞的早期、晚期凋亡率以及Cleave-caspased-3蛋白的表達(dá)量均顯著升高，且聯(lián)用組顯著高于紫杉醇、PD98059單用組（P<0.05）;各給藥組的細(xì)胞遷移數(shù)均顯著減少，且聯(lián)用組顯著少于紫杉醇、PD98059單用組（P<0.05）。結(jié)論：紫杉醇、PD98059均可抑制人胃印戒細(xì)胞癌KATO Ⅲ細(xì)胞的增殖和遷移，且紫杉醇還可促進(jìn)該細(xì)胞的凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，上述作用可能與抑制MEK/ERK通路有關(guān)。兩藥聯(lián)用的效果優(yōu)于紫杉醇或PD98059單用。

關(guān)鍵詞 人胃印戒細(xì)胞癌;紫杉醇;PD98059;增殖;凋亡;凋亡相關(guān)蛋白;遷移;絲裂原激活蛋白激酶激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路;KATO Ⅲ細(xì)胞

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of MEK/ERK pathway specific inhibitor PD98059 combined with paclitaxel on the proliferation and apoptosis of human gastric signet ring cell carcinoma （SRCC） cells. METHODS： Using human SRCC KATO Ⅲ cells as object， CCK-8 assay was used to detect cell proliferation after treated with paclitaxel， PD98059 and two drug combination for 48 h， and the proliferation rate was calculated. Flow cytometry， Western blotting and Transwell assay were used to detect the cell proliferation， the expression of apoptosis related protein （Cleaved-caspase-3） and cell migration after treated with paclitaxel， PD98059 and two drug combination for 48 or 24 h. RESULTS： After treated with paclitaxel （1 μg/mL）， PD98059 （5， 20， 40 μmol/L） and two drug combination （1 μg/mL+5， 20， 40 μmol/L）， the proliferation rate of cells was increased significantly in administration groups， and the combination groups were significantly higher than paclitaxel and PD98059 alone groups （P<0.05）. After treated with paclitaxel （1 μg/mL）， PD98059 （5， 20， 40 μmol/L） and two drug combination （1 μg/mL+40 μmol/L）， early and late apoptosis rate， the protein expression of Cleaved-caspase-3 were significantly increased in paclitaxel group and combination group; combination group was significantly higher than paclitaxel and PD98059 alone group （P<0.05）. The number of migrated cells in administration groups were reduced significantly， and the combination group was significantly lower than paclitaxel and PD98059 alone group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Paclitaxel and PD98059 can inhibit the proliferation and migration of human SRCC KATO Ⅲ cells， paclitaxel can also promote the apoptosis and the expression of apoptosis related protein， which may be related to the inhibition of MEK/ERK pathway. The effect of the combination of the two drugs is better than paclitaxel or PD98059 alone.

KEYWORDS? ?Human grastric signet ring cell carcinoma; Paclitaxel; PD98059; Proliferation; Apoptosis; Apoptosis related protein; Migration;MEK/ERK pathway; KATO Ⅲ cells

胃印戒細(xì)胞癌是基于微觀組織形態(tài)學(xué)分型的一種特殊病理類(lèi)型的胃癌，其鏡檢可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)豐富、充滿黏液，細(xì)胞核被擠壓于胞質(zhì)一側(cè)呈“印戒”樣[1-2]。近年來(lái)，隨著幽門(mén)螺旋桿菌根治術(shù)的應(yīng)用，胃癌的發(fā)病率雖有所下降，但胃印戒細(xì)胞癌的發(fā)病率卻有所上升，占胃癌總發(fā)病率的8%～30%[1-3];同時(shí)有報(bào)道指出，與非印戒細(xì)胞癌相比，胃印戒細(xì)胞癌多發(fā)于年輕女性[4]。目前，胃印戒細(xì)胞癌的臨床治療主要以手術(shù)及化療為主，但胃印戒細(xì)胞癌患者對(duì)化療藥物不敏感，且腫瘤細(xì)胞一旦突破黏膜下層，則極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[5]。PD98059是一種絲裂原激活蛋白激酶激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MEK/ERK）通路的特異性抑制劑，能有效阻止MEK對(duì)ERK的磷酸化，阻滯細(xì)胞內(nèi)相關(guān)通路信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡等一系列生物反應(yīng)[6]。紫杉醇作為一種天然植物來(lái)源的抗癌藥物，廣泛應(yīng)用于包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的臨床治療，其單藥有效率達(dá)20%～40%，但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，靶癌細(xì)胞產(chǎn)生的分子學(xué)抵抗限制了該藥抗癌作用的發(fā)揮[7-8]。有研究指出，PD98059與紫杉醇等其他抗腫瘤藥物聯(lián)用可增強(qiáng)后者的抗癌效果[9];且本課題組前期研究也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)?；诖?，本研究擬通過(guò)分析PD98059聯(lián)合紫杉醇對(duì)人胃印戒細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，初步探討聯(lián)合用藥的抗癌效果，旨在為胃印戒細(xì)胞癌的治療提供新的靶點(diǎn)和思路。

1 材料

1.1 儀器

FORM 361型細(xì)胞培養(yǎng)箱、MK2型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;Accuri C6型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）;Mini-Protean型蛋白電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）;5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）;Ti-E型顯微鏡（日本Nikon公司）;5702型常溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendrof公司）。

1.2 藥品與試劑

紫杉醇對(duì)照品（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：IP0020，純度：>98%）;PD98059對(duì)照品（美國(guó)MCE公司，批號(hào)：12764，純度：99.33%）;IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)分別為8228124、41G3332K、1730153）;Transwell測(cè)試盒（美國(guó)Corning公司，批號(hào)：27113030）;CCK-8試劑盒、含磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白上樣緩沖液、聚丙烯酰胺凝膠配膠試劑盒、結(jié)晶紫染色試劑（上海碧云天生物科技有限公司，批號(hào)分別為C0038、P0013B、P0010、P0015L、P0012AC、C0121）;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：1753025）;山羊抗兔分裂型胱天蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）抗體、山羊抗兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（美國(guó)CST公司，批號(hào)分別為12/2017、10/2017、06/2017）;ECL發(fā)光試劑盒（美國(guó)Millipore公司，批號(hào)：1722003）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人胃印戒細(xì)胞癌細(xì)胞株KATO Ⅲ由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將胃印戒細(xì)胞癌KATO Ⅲ細(xì)胞解凍、復(fù)蘇并接種至含有10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱“完全培養(yǎng)基”）中，于5%CO2、37 ℃條件（下同）下培養(yǎng)，約3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞增殖情況

采用CCK-8法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KATO Ⅲ細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，將其用完全培養(yǎng)基調(diào)整至5×104個(gè)/mL，按100 μL/孔接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組，紫杉醇組（1 μg/mL），PD98059低、中、高劑量組（5、20、40 μmol/L）以及紫杉醇+PD98059聯(lián)用組（1 μg/mL紫杉醇分別與5、20、40 μmol/L PD98059聯(lián)用），各給藥組劑量參考本課題組前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基100 μL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)1 h后，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：增殖抑制率=[（對(duì)照組細(xì)胞平均OD值-試驗(yàn)組細(xì)胞平均OD值）/對(duì)照組細(xì)胞平均OD值]×100%。上述試驗(yàn)重復(fù)3次（下同）。

2.3 細(xì)胞凋亡情況

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的KATO Ⅲ細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，將其用完全培養(yǎng)基調(diào)整至5×106個(gè)/mL，按100 μL/孔接種至6孔板中，培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、紫杉醇組（1 μg/mL）、PD98059組（40 μmol/L）和紫杉醇+PD98059聯(lián)用組（1 μg/mL+40? ? ?μmol/L），各給藥組劑量參考“2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基2 mL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，以800 r/min離心5 min，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗3次。隨后用PBS調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/mL，取上述細(xì)胞懸液1 L，以800 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀加入Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液195 μL，輕輕重懸，然后依次加入Annexin Ⅴ-FITC染色液5 μL和PI染色液10 μL，輕輕混勻，于冰浴中染色20 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，并使用Excel 2007軟件計(jì)算各組細(xì)胞的早期、晚期凋亡率。

CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示，各給藥組細(xì)胞的增殖抑制率均較對(duì)照組顯著升高，且兩藥聯(lián)用組的抑制率顯著高于紫杉醇、PD98059同劑量單用組;同時(shí)，20 μmol/L PD98059的抑制作用與1 μg/mL紫杉醇相當(dāng)，且抑制率有隨PD98059劑量增加而升高的趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，兩藥聯(lián)用對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用明顯優(yōu)于紫杉醇、PD98059單獨(dú)使用，這可能與PD98059對(duì)細(xì)胞增殖的抑制主要是作用于G1期，將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期[17]，而紫杉醇則主要是將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期[10-11]有關(guān)。

有研究指出，減少細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中ERK的磷酸化能有效抑制胱天蛋白酶9（Caspase-9）的表達(dá)，從而發(fā)揮減少細(xì)胞凋亡的作用，因此抑制MEK/ERK通路常作為誘導(dǎo)腫瘤凋亡的靶點(diǎn)[18]。Caspase-9作為凋亡通路的啟動(dòng)者，在收到上游信號(hào)后，可通過(guò)自剪接而激活，隨后引發(fā)Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Caspase-3作為Caspase-9的響應(yīng)分子之一，在被Caspase-9激活后，其可通過(guò)剪切產(chǎn)生活性Cleaved-caspase-3，后者可直接降解細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18-19]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting法分別檢測(cè)了KATO Ⅲ細(xì)胞的凋亡情況和凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，紫杉醇組和紫杉醇+PD98059聯(lián)用組細(xì)胞的早期、晚期凋亡率和Cleaved-caspase-3的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，且聯(lián)用組顯著高于紫杉醇、PD98059單用組;而雖PD98059有增加細(xì)胞凋亡和凋亡蛋白表達(dá)的趨勢(shì)，但組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示PD98059單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)胃印戒細(xì)胞癌細(xì)胞的促凋亡作用并不明顯;而當(dāng)該藥與紫杉醇聯(lián)用時(shí)，則可明顯促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，提高相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)水平，并可同時(shí)增強(qiáng)紫杉醇對(duì)KATO Ⅲ細(xì)胞的促凋亡作用，其機(jī)制可能與PD98059通過(guò)抑制MEK/ERK通路從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性有關(guān)[20]。

本研究進(jìn)一步通過(guò)Transwell法檢測(cè)了PD98059聯(lián)合紫杉醇對(duì)KATO Ⅲ細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，各給藥組的遷移細(xì)胞數(shù)均較對(duì)照組顯著減少，且聯(lián)用組顯著少于紫杉醇、PD98059單用組。這提示兩種藥物均可抑制KATOⅢ細(xì)胞的遷移，其中紫杉醇可通過(guò)降低相關(guān)細(xì)胞機(jī)能、PD98059可通過(guò)抑制ERK磷酸化來(lái)減少基質(zhì)金屬蛋白酶2等的表達(dá)，從而發(fā)揮遷移抑制作用[21]。與此同時(shí)，兩藥聯(lián)用的抑制作用強(qiáng)于任一藥物單用，筆者推測(cè)這可能與兩藥效果疊加有關(guān)。

綜上所述，紫杉醇和PD98059均可抑制人胃印戒細(xì)胞癌KATO Ⅲ細(xì)胞的增殖和遷移，且紫杉醇還可促進(jìn)該細(xì)胞的凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，上述作用可能與抑制MEK/ERK通路有關(guān);兩藥聯(lián)用的效果明顯優(yōu)于紫杉醇或PD98059單用。本研究可為胃印戒細(xì)胞癌的臨床治療提供新策略，但PD98059協(xié)同紫杉醇對(duì)人胃印戒細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)揮抑制作用的分子機(jī)制仍未明確，且相關(guān)研究結(jié)論并未通過(guò)體內(nèi)研究予以證實(shí)，故有待進(jìn)一步探索。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] PERNOT S，VORON T，PERKINS G，et al. Signet-ring cell carcinoma of the stomach：impact on prognosis and specific therapeutic challenge[J]. World J Gastroenterol，2015，21（40）：11428-11438.

[ 2 ] 聶愛(ài)英，梁麗娟，雷超，等.胃印戒細(xì)胞癌臨床病理特點(diǎn)的分析[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2017，25（6）：914-917.

[ 3 ] AKABAH PS，MOCAN S，MOLNAR C，et al. Importance of optical diagnosis in early gastric cancer：a case report of early gastric signet ring cell carcinoma[J]. Niger J Clin Pract，2017，20（10）：1342-1345.

[ 4 ] 徐仲航，金殷植，房學(xué)東.胃印戒細(xì)胞癌的研究進(jìn)展[J].中華胃腸外科雜志，2018，21（10）：1196-1200.

[ 5 ] 崔景利，梁寒，鄧靖宇，等.胃印戒細(xì)胞癌的臨床病理特點(diǎn)和預(yù)后分析[J].中華腫瘤雜志，2015，37（5）：367-370.

[ 6 ] LEE KC，TSAI JJ，TSENG CW，et al. Amentoflavone inhibits erk-modulated tumor progression in hepatocellular carcinoma in vitro[J]. In Vivo，2018，32（3）：549-554.

[ 7 ] 陳偉，季明華，唐金海.乳腺癌紫杉醇耐藥的機(jī)制[J/CD].中華乳腺病雜志：電子版，2015，9（4）：275-279.

[ 8 ] 田甜甜，李艷艷，沈琳，等.胃癌細(xì)胞中miR-135a表達(dá)對(duì)紫杉醇敏感性的影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2016，36（5）：672-677.

[ 9 ] LI Y，YANG Q. Effect of PD98059 on chemotherapy in patients with colorectal cancer through ERK1/2 pathway[J]. J BUON，2019，24（5）：1837-1844.

[10] JIANG X，ZHANG B，ZHOU Z，et al. Enhancement of radiotherapy efficacy by pleiotropic liposomes encapsulated paclitaxel and perfluorotributylamine[J]. Drug Deliv，2017，24（1）：1419-1428.