彭陳文 孫茗威 何沛聰

【摘 要】 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究六君子湯抗肺癌的作用機(jī)制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）獲得LJS活性成分，采用Swiss Target Prediction平臺預(yù)測活性成分的潛在靶點(diǎn)，并檢索Online Mendelian Inheritance in Man等疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，以獲得LJS抗肺癌的作用靶點(diǎn)。借助String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選degree值排名前10的靶點(diǎn)。采用Metascape平臺對LJS抗肺癌作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析。結(jié)果：從LJS中篩選出178個(gè)活性成分，59個(gè)與LJS抗肺癌相關(guān)靶蛋白。KEGG通路富集結(jié)果顯示其參與調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、白介素17信號通路等信號通路。結(jié)論：LJS通過“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”方式發(fā)揮抗肺癌作用。

【關(guān)鍵詞】 六君子湯;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);肺癌;作用機(jī)制

【中圖分類號】R285.5 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2020）1-0031-04

Abstract：Objective To study the mechanism of Liu Junzi Soup（LJS） for Anti-Lung Cancer based on network pharmacology. Methods The LJS active component was obtained by the Chinese Medicine System Pharmacology Database （TCMSP）， the potential target of the active ingredient was predicted by the Swiss Target Prediction platform， and the disease target database such as Online Mendelian Inheritance in Man was searched to obtain the target of LJS against lung cancer.The PPI network was built with the help of the String database and Cytoscape 3.2.1 software， and the top 10 targets of the degree value were screened.The target enrichment analysis of KEGG pathways were analyzed by Metascape database.Results A total of 85 active components and 59 Liu Junzi Soup for anti-Lung Cancer-related targets were screened from Liu Junzi Soup.After enrichment analysis by KEGG pathway， it was found to regulate PI3K-Akt signaling pathway，EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance，IL-17 signaling pathway and other signaling pathways.Conclusions LJS exerts anti-lung cancer effects through a “multi-component-multi-target-multi-channel” approach.

Keywords：Liu Junzi Soup;Network Pharmacology;Lung Cancer;Mechanism

肺癌對人類的生命健康威脅巨大。由于吸煙、空氣污染等因素，近年來肺癌的發(fā)病率與死亡率持續(xù)上升，在我國，肺癌已經(jīng)成為發(fā)病率與死亡率均為第一位的惡性腫瘤[1]。近年來化療藥物聯(lián)合中藥已成為治療肺癌的最佳模式?！疤搫t補(bǔ)其母”，中醫(yī)藥多以培土生金法治療肺癌，補(bǔ)脾以養(yǎng)肺，固護(hù)正氣。據(jù)臨床文獻(xiàn)報(bào)道，健脾理氣法能夠提高和改善肺癌患者的臨床療效和生活質(zhì)量[2]。六君子湯（Liu Junzi Soup，LJS）具有健脾益胃、化痰祛濕、調(diào)暢氣機(jī)的功效，臨床上用于晚期肺癌的治療取得了良好的療效[3]，但其抗肺癌的具體機(jī)制尚不明確。

近年來興起的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究思維具有整體性與系統(tǒng)性，這與中醫(yī)藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用特點(diǎn)相吻合[4-5]，因而適合用于中藥方劑作用機(jī)制的研究。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對LJS抗肺癌作用機(jī)制進(jìn)行探討，為其作用機(jī)制的深入研究提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 LJS活性成分遴選 將LJS藥物名稱（人參、茯苓、白術(shù)、甘草、陳皮、半夏）輸入到TCMSP數(shù)據(jù)庫“Herb name”搜索欄里，下載六君子湯相關(guān)藥物活性成分的txt文本，將txt文本引入到excel表格中，獲得LJS藥物成分信息。使用口服生物利用度（OB值）大于20%和藥物相似性（DL值）大于0.18的限定條件對得到的藥物活性成分進(jìn)行篩選，進(jìn)而得到LJS活性成分。

1.2 LJS活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測 將LJS活性成分導(dǎo)入PubChem數(shù)據(jù)庫，獲得化學(xué)成分的“Canonical SMILES”，然后將每一成分的“Canonical SMILES”輸入到Swiss Target Prediction靶點(diǎn)預(yù)測平臺，預(yù)測LJS活性成分的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 LJS抗肺癌相關(guān)靶點(diǎn)收集 通過Therapeutic Target Database （TTD）、Online Mendelian Inheritance in Man （OMIM）、Disease Gene Search Engine （DiGSeE）、Drug Bank及Human Phenotype Ontology（HPO）5個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫，以關(guān)鍵詞“Lung Cancer”進(jìn)行檢索，獲得肺癌相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，除去重復(fù)靶點(diǎn)。將收集到的疾病靶點(diǎn)與1.2項(xiàng)下獲得的成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行對比，最后得到LJS抗肺癌相關(guān)作用靶點(diǎn)。

1.4 LJS抗肺癌的靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建 將1.3項(xiàng)收集到的LJS抗肺癌的作用靶點(diǎn)輸入到Sring數(shù)據(jù)庫，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，使用Cytoscape3.2.1軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩出degree值排名前10的靶點(diǎn)。

1.5 靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析 登陸Metascape平臺，輸入LJS抗肺癌作用靶點(diǎn)，選項(xiàng)“Input as species”和“Analysis as species”均選擇“人類（Homo sapiens）”，P值設(shè)為小于0.01，對靶蛋白進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)結(jié)果數(shù)據(jù)中每個(gè)條目的P值從小到大進(jìn)行排序，篩選前10條目，并進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 LJS活性成分篩選 通過OB>30%，DL>0.18的篩選條件，共得到85個(gè)活性成分。半夏12個(gè)，包括黃芩素、黃芩苷、豆甾醇、β-谷甾醇等;陳皮4個(gè)，包括川陳皮素、柑橘素等;白術(shù)7個(gè)，包括白術(shù)內(nèi)酯、β-香樹素、長葉烯、等;茯苓15個(gè)，包括茯苓酸、松苓新酸等;人參19個(gè)，包括山奈酚、高麗槐素、人參皂苷Rg5、人參皂苷Rg2等;甘草28個(gè)，包括槲皮素、毛異黃酮、黃甘草異黃酮A等。

2.2 LJS活性成分靶點(diǎn)預(yù)測 通過Swiss Target Prediction平臺，刪除重復(fù)項(xiàng)后，共獲得178個(gè)活性成分靶點(diǎn)。將178個(gè)作用靶點(diǎn)與OMIM、 TTD、DiGSeE、Drug Bank、以及Human Phenotype Ontology（HPO）5個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫收集到的肺癌相關(guān)基因靶點(diǎn)進(jìn)行比對，最終得到59個(gè)LJS抗肺癌的相關(guān)靶蛋白。

2.3 59個(gè)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將59個(gè)靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)輸入Cytoscape 3.2.1軟件繪制靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。此網(wǎng)絡(luò)共有59個(gè)節(jié)點(diǎn)，459條邊（“邊”表示兩個(gè)靶點(diǎn)存在相互作用關(guān)系），靶點(diǎn)的degree值越大則形狀越大。該網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前10的靶蛋白，分別為絲/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、熱休克蛋白90α（HSP90α）、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、腫瘤壞死因子（TNF）、雌激素受體1（ESR1）、絲裂原激活蛋白激酶8（MAPK8）、前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、雄激素受體（AR）、基質(zhì)金屬蛋白酶 9（MMP9）。

2.4 KEGG通路富集分析 使用Metascape平臺對LJS抗肺癌的59個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，篩選前10條目（P值從小到大進(jìn)行排序），并進(jìn)行可視化處理，結(jié)果如圖2所示.主要有PI3K-Akt信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、白介素17信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路等。3 討論

3.1 LJS抗肺癌涉及的重要藥物成分 研究結(jié)果表明，黃芩素、白術(shù)內(nèi)酯、茯苓酸、人參皂苷等是LJS藥物活性成分。黃芩素對肝癌、乳腺癌以及宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞有明顯抑制細(xì)胞增殖的作用[6]。研究表明[7]，黃芩素對肺癌細(xì)胞的增值具有一定抑制作用，其可能通過上調(diào)Caspase - 3蛋白的表達(dá)與下調(diào)urvivin蛋白和Eph A2蛋白的表達(dá)來誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。白術(shù)內(nèi)酯是白術(shù)的主要成分，具有抗炎、抗過敏、抗腫瘤等多種作用[8]。研究顯示[9]，白術(shù)內(nèi)酯可通過抑制TLR4/MyD88通路降低肺癌細(xì)胞侵襲能力與增值能力。人參皂苷是人參的有效成分，其可通過多種途徑增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫能力，具有明顯的抗腫瘤能力[10]。實(shí)驗(yàn)表明[11]，人參皂苷可顯著抑制小鼠非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞Lewis細(xì)胞中免疫檢查點(diǎn)程序性死亡分子1配體（PD-L1）的表達(dá)，通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路，阻斷由PD-L1介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，加強(qiáng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答功能，抑制腫瘤細(xì)胞生長。

3.2 LJS抗肺癌涉及的重要作用靶點(diǎn) LJS抗肺癌作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，絲/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、熱休克蛋白90α（HSP90α）、腫瘤壞死因子（TNF），基質(zhì)金屬蛋白酶 9（MMP9）等10個(gè)靶點(diǎn)的Degree值排在59個(gè)靶蛋白前10位。AKT被認(rèn)為是一種癌基因，可通過多種途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝和凋亡。AKT1是AKT的重要亞型，與胃癌、肺癌等多種惡性腫瘤發(fā)病密切相關(guān)。王嘉等[12]研究顯示，AKT1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯高于肺泡對照組和支氣管對照組，提示AKT1在肺癌的發(fā)生過程中起促癌作用。HSP90α是一種熱休克蛋白，能與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的癌基因結(jié)合，維持其致癌性，且分泌到細(xì)胞外的HSP90α可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移[13]。

3.3 LJS抗肺癌涉及的重要生物通路 KEGG信號通路結(jié)果顯示，LJS抗肺癌涉及PI3K-Akt、白介素17、血管內(nèi)皮生長因子等信號通路。PI3K-Akt信號通路是機(jī)體內(nèi)主要通路之一，其在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等[14]。倪琛琛等[15]研究100例肺癌組織中PI3K及Akt蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示前兩者在肺癌組織的陽性表達(dá)率均顯著高于相應(yīng)癌旁組織的陽性表達(dá)率。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種活性很強(qiáng)生長因子，對血管的發(fā)生與形成具有促進(jìn)作用。多種惡性腫瘤中VEGF的表達(dá)水平與患者5年存活率呈負(fù)相關(guān)，腫瘤細(xì)胞通過分泌VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增值和血管形成，促進(jìn)腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移[16]。

本研究結(jié)果顯示，LJS抗肺癌的過程涉及了多個(gè)活性成分、靶點(diǎn)及通路，與中醫(yī)藥診療疾病多成分-多靶標(biāo)-多通路的特點(diǎn)相符合，可作為LJS抗肺癌作用機(jī)制的預(yù)測探討，為下一步實(shí)驗(yàn)研究提供思路與參考。

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（收稿日期：2019-10-23 編輯：程鵬飛）