彭志清，廖 杰, 李玉潔，馮文林*，楊曉占

(1.重慶理工大學 理學院 物理與能源系, 重慶 400054;2.綠色能源材料技術(shù)與系統(tǒng)重慶市重點實驗室, 重慶 400054;3.中山大學附屬第六醫(yī)院, 廣東 廣州 510665)

1 引 言

近年來，食品安全問題備受關(guān)注。其中，食源性細菌嚴重影響現(xiàn)代人的健康，有人甚至被奪去生命。大腸桿菌是一種常見的食源性病原體，全球每年有百萬人受它影響，特別是腸出血型大腸桿菌，感染后會引起腹痛和腹瀉等，甚至危及生命[1]。傳統(tǒng)的食源性致病菌檢測方法相對準確且成本低廉，但是耗時費力，可能錯失控制食源性疾病的最佳預防和治療時間[2]。因此，免疫學檢測技術(shù)、分子生物學技術(shù)等快速檢測方法被提出，但這些檢測方法通常需要特定的檢測儀器和專業(yè)人員，而且其靈敏性和響應時間仍需要改進[3]。光纖傳感器具有測量精度高、反應靈敏等優(yōu)點，在生物醫(yī)學、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域得到廣泛的應用[4]。將選擇性強的敏感材料涂覆于合適的光纖傳感結(jié)構(gòu)，是解決大腸桿菌快速、靈敏檢測的有效方法之一。

在敏感材料中，石墨烯是由碳原子以sp2雜化軌道組成的六角蜂巢結(jié)構(gòu)的二維碳納米材料，具有優(yōu)異的物理化學性能，而且對石墨烯進行改性后可賦予它一些額外的特性。目前，國內(nèi)外對石墨烯生物傳感器進行了廣泛研究[5]，基于石墨烯的傳感器主要是利用其高比表面積及優(yōu)異的導電性等。2018年，Thakur等人使用基于超薄Al2O3層鈍化的還原氧化石墨烯場效應晶體管，實時檢測大腸桿菌，該傳感器對大腸桿菌具有響應快速和選擇性高等優(yōu)點，但其循環(huán)使用性能有待提高[6]。2019年，Gupta等人利用銅金屬有機框架材料與聚苯胺復合，制成電化學生物傳感器，該傳感器可在一定的響應時間(約2 min)內(nèi)實現(xiàn)對極低濃度大腸桿菌(2 cfu/mL)的高靈敏檢測[7]。

基于此，本文設(shè)計了一種基于馬赫-曾德爾干涉原理的光纖大腸桿菌傳感器，并在感測區(qū)的光纖表面鍍上一層改性石墨烯敏感膜。當光纖表面的敏感膜特異吸附大腸桿菌后，感測區(qū)光纖包層的有效折射率發(fā)生改變，在光譜儀上可觀察到干涉圖譜的偏移[8-9]，從而將大腸桿菌的濃度信息與光干涉信息聯(lián)系起來。該全光纖結(jié)構(gòu)傳感器具有制作工藝簡單、穩(wěn)定性好、響應快速和抗干擾能力強等優(yōu)點，可實現(xiàn)對病原體的高效快速檢測。

2 基本原理

2.1 傳感機理

刀豆凝集素(Con A)是一種豆科植物凝集素，與以α-1，2糖苷鍵連接的甘露二糖和甘露三糖有最大的親和力，能與細胞膜糖蛋白的葡萄糖部分特異結(jié)合[10]。而大腸桿菌的細胞膜中的脂多糖恰好可以作為特異結(jié)合Con A的靶點?；诖?，本文設(shè)計并構(gòu)建了能特異結(jié)合大腸桿菌的光纖生物傳感器。

結(jié)合1-氨基芘(1-Apy)表面的氨基(-NH2)和麥芽糖表面的羰基(C=O)，使兩者以Schiff′s base反應偶聯(lián)，得到產(chǎn)物為Mal-Apy。又因1-Apy中芘環(huán)良好的平面結(jié)構(gòu)，易在石墨烯表面發(fā)生π-堆積自組裝，進而穩(wěn)定結(jié)合光纖表面的石墨烯[10]。而復合材料中的麥芽糖可與Con A高效結(jié)合，使Con A穩(wěn)定附著在光纖表面，用于特異性識別大腸桿菌。

2.2 傳感光學原理

圖1為光纖傳感實驗裝置示意圖，將傳感光纖固定在水槽中，插圖為傳感區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖。光子晶體光纖(Photonic Crystal Fiber, PCF)與標準單模光纖進行雙粗錐熔接，形成粗錐型馬赫-曾德爾干涉結(jié)構(gòu)。一束光進入第一段單模光纖后，經(jīng)過第一個粗錐熔接點被分為兩部分，一部分光繼續(xù)在纖芯內(nèi)傳輸，另一部分光進入PCF的包層中，在第二個熔接點兩部分光匯聚。由于兩部分光經(jīng)過的路徑和介質(zhì)不同，光在第二段單模光纖匯聚傳輸時存在光程差，因此產(chǎn)生干涉[11-13]。

圖1 光纖傳感實驗裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of optical sensing experimental setup

傳感器的傳輸強度定義為[14-15]：

(1)

其中：I1和I2分別為纖芯和包層模的強度；Δφ為模間相位差，表達式如下：

(2)

式中λ為入射光的波長；L為感測區(qū)長度；Δneff=ncore-ncladding，為纖芯和包層的有效折射率差。

在PCF的包層表面涂覆敏感膜，當它吸附待測物時，包層的有效折射率發(fā)生變化，而纖芯的折射率不變，因此干涉波谷將發(fā)生變化，其m階波谷變化量表示為：

λ=[2(Δneff+Δn)L-2ΔneffL]/(2m+1)=

2ΔnL/(2m+1).

(3)

由式(3)可以看出：當包層有效折射率變大時，(Δneff+Δn)減小，即Δn變?yōu)樨撝?，干涉波谷向短波長方向移動，即光譜發(fā)生藍移。

測試時，將不同濃度的大腸桿菌加入水槽中，在光譜儀上可觀察到不同波長的干涉情況。因光子晶體光纖表面涂覆了偶聯(lián)Con A的改性石墨烯敏感膜，并結(jié)合粗錐型光纖馬赫-曾德爾干涉原理，可通過對光譜的檢測實現(xiàn)對大腸桿菌的特異快速檢測。

3 敏感材料的制備與表征

3.1 試劑與儀器

實驗中使用的實心光子晶體光纖由武漢長飛光纖光纜有限公司生產(chǎn)；石墨烯量子點(厚度：1～6 nm；橫向尺寸<10 nm)由南京先豐納米材料科技有限公司生產(chǎn)；1-Apy(AR, 97%)由Acros公司生產(chǎn)；麥芽糖(AR, 97%)和氰基硼氫化鈉(AR, 95%)由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；大腸桿菌由陸軍軍醫(yī)大學培養(yǎng)提供；激光光源為康冠ASE寬帶光源；光譜分析儀為日本橫河AQ6370D型光譜分析儀；拉錐熔接機為古河S178C光纖熔接機。實驗用水均為Molecular制造的超純凈水 (18.25 MΩ· cm)。

3.2 改性石墨烯材料制備

首先，取12 mL體積比為1∶1的磷酸鹽緩沖液(PBS)和甲醇的混合液，加入100 μmol麥芽糖和150 μmol 1-Apy，溶解后靜置1 h；然后加入300 μmol氰基硼氫化鈉后密封，80 ℃的磁力攪拌48 h，對得到的混懸液進行抽濾洗滌，得到綠色粉末；將粉末用5 mL乙醇均勻分散后，加入10 mL的PBS緩沖液超聲15 min，確保粉末均勻分散，然后再加入2 mL的石墨烯量子點后繼續(xù)超聲15 min，得到綠色溶液，于4 ℃保存。鍍膜前，取2 mL上述溶液于小燒杯中，加入0.002 μmol的刀豆凝聚素A，低溫超聲15 min后即可得到需要的復合材料溶液[15]。實驗中，為使Mal-Apy材料能夠更好地包覆在光纖上，加入石墨烯量子點。

3.3 石墨烯復合膜涂覆光子晶體光纖制備

用全自動光纖熔接機將光子晶體光纖的兩端與兩根標準單模光纖進行粗錐熔接，形成基于SMF-PCF-SMF的光纖馬赫-曾德爾干涉?zhèn)鞲薪Y(jié)構(gòu)。在光子晶體光纖的包層上涂敷一層石墨烯復合膜的制備工藝主要為：取上述制備的復合材料溶液進行超聲15 min后，將傳感結(jié)構(gòu)中的光子晶體光纖置于載玻片上，在光纖周圍均勻滴加復合材料溶液并充分浸涂10 min，使光子晶體光纖表面形成一層改性石墨烯復合膜，重復3～6次，直至在顯微鏡下觀察到光纖表面有一層淡黃色的涂層。再將其放入冷凍干燥機中充分干燥，使敏感材料與光纖之間穩(wěn)定黏附。

3.4 復合材料的表征

復合材料的X射線能譜分析采用賽默飛世爾科技(荷蘭)有限公司生產(chǎn)的FEI Talos F200S型場發(fā)射透射電子顯微鏡進行測試。材料的傅里葉紅外光譜借助賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產(chǎn)的Nicolet iS50型傅里葉變換紅外光譜儀進行測試。拉曼光譜儀采用法國Jobin Yvon S.A.S公司生產(chǎn)的LabRAM HR Evolution型顯微共聚焦拉曼光譜儀。

4 實驗結(jié)果與討論

4.1 復合材料的表征分析

4.1.1 X射線能譜分析

光纖表面復合膜的X射線能譜分析結(jié)果如圖2所示。圖2表明，該樣品主要含有N，O，Na，P，K，Cu和Ca元素，圖2(a)和2(b)分別為C元素和N元素分布圖，其中C元素主要來源于石墨烯量子點，較強的N元素主要來源于1-Apy中的氨基和Con A的組成成分氨基酸，O元素主要來源于刀豆素與麥芽糖，Na，P，K主要來源為氰基硼氫化鈉和PBS緩沖液，少量的Cu和Ca為雜質(zhì)。能譜分析結(jié)果初步表明，Con A結(jié)合到了光子晶體光纖表面。

圖2 改性石墨烯材料的能譜分析Fig.2 Energy spectrum analysis of modified graphene

4.1.2 傅里葉變換紅外光譜分析

圖3是復合膜的傅里葉變換紅外光譜圖。圖3中，1 070.09 cm-1處的峰屬于直鏈C-C伸縮振動，歸屬于Con A中氨基酸的C-C鍵；958.51 cm-1處的峰屬于CN-O的伸縮振動，原因是在材料制備過程中部分氨基被氧化；1 249.97 cm-1處的峰屬于NO3的反對稱伸縮振動，由氨基被氧化所導致；當?shù)獨涞恼駝宇l率為1 560～1 535 cm-1時，該振動模式屬于仲酰胺振動，該峰為NH面內(nèi)彎曲振動和CN伸縮振動耦合的結(jié)果，主要是NH的面內(nèi)變角振動，因此1 538.54 cm-1處的峰屬于氨基的一個特征峰；833.22 cm-1處的寬峰屬于氨基中的NH2扭曲振動特征峰；737.68 cm-1處的峰也屬于氨基中NH的面外彎曲振動特征峰[16-19]。分析結(jié)果進一步證實，敏感膜中確含有Con A。

圖3 改性石墨烯材料的傅里葉紅外光譜分析Fig.3 Fourier infrared spectrum of modified graphene material

圖4 改性石墨烯材料的拉曼光譜分析Fig.4 Raman spectroscopy analysis of the modified graphene material

4.1.3 拉曼光譜分析

敏感膜的拉曼光譜測試結(jié)果如圖4所示。其中1 011，1 210，1 215 cm，1 404 cm-1等峰都與α-丙氨酸相近，1 011，1 407 cm-1等峰都與β-丙氨酸相近，540，1 050，1 404 cm，1 618 cm-1等峰都與6-氨基己酸相近，1 050，1 320，1 404，1 585，1 618 cm-1等峰都與甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸相近[20-23]。綜合上述分析結(jié)果，確認了氨基酸的存在，證明了該樣品中含有Con A。

4.2 大腸桿菌傳感實驗

使用涂布分離法將大腸桿菌分別配置成濃度為50，100，200，300，400，500，600 cfu/mL 7種菌液，分別置于離心管中，以備測試，每個濃度測試5組數(shù)據(jù)，并對所得數(shù)據(jù)用Origin軟件進行平均篩選處理，即得如圖5所示的光譜圖。從圖中可看出隨著濃度的增加，傳感器的干涉波谷呈現(xiàn)藍移。其原因是：改性石墨烯復合敏感膜中的Con A可與溶液中的大腸桿菌特異性結(jié)合，薄膜折射率將隨之改變，進而改變光子晶體光纖包層的有效折射率，導致光子晶體光纖中纖芯與包層存在的光程差發(fā)生改變，監(jiān)測的干涉波谷將隨之發(fā)生規(guī)律性移動。實驗結(jié)果表明：該傳感器在大腸桿菌濃度為50～600 cfu/mL內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，離散點是實際測量點，直線是線性擬合曲線，線性度較高(R2=0.956 49)。進一步分析表明，該傳感器對大腸桿菌的靈敏度為3.43 pm/(cfu·mL-1)。

圖5 不同濃度大腸桿菌的光譜響應Fig.5 Spectral response of E. coli with different concentrations

圖6 大腸桿菌傳感器的響應時間Fig.6 Response time of E. coli sensor

選用濃度為400 cfu/mL的大腸桿菌菌液加入水槽中來測試傳感器的響應時間。實驗中以3 s為取樣間隔保存光譜數(shù)據(jù)，實驗過程在室溫下進行，測試結(jié)果如圖6所示。該傳感器從開始到響應完成所需時間僅15 s，說明該生物傳感器能實現(xiàn)快速響應。

4.3 傳感器檢測限

依據(jù)國際純粹與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)給出的檢測限(Limit Of Detection，LOD)定義方程，即采用三倍的標準偏差除以擬合曲線斜率，由此檢測限為[24-26]：

LOD=3σ/K，

(4)

其中：σ≈76.81 pm，表示空白組的標準偏差；K≈3.43 pm/(cfu·mL-1)，表示實驗組的擬合曲線斜率。通過計算可知，該傳感器的檢測限為67.18 cfu/mL。

需要特別指出的是，實驗中也選取了金黃色葡萄球菌和乳酸乳球菌等細菌進行了對比測試，由于這些菌的細胞膜中沒有糖類物質(zhì)，與Con A之間沒有特異性的結(jié)合，雖然菌液濃度的變化會引起折射率的微弱變化，進而引起干涉譜圖的移動，但這種移動非常微弱，可忽略不計。另外，因Con A是一種高分子蛋白，過高的溫度(≥50 ℃)容易使它發(fā)生不可逆的變性，且大腸桿菌的最佳生存溫度為37 ℃，在70 ℃下一分鐘即可滅活，該傳感器一般適合常溫使用，因此本研究未對溫度進行研究。同時，該傳感器的敏感材料與大腸桿菌是特異敏感結(jié)合，若要恢復傳感器的傳感活性，需要在PBS緩沖液中低溫充分浸泡或沖洗，因此，具體恢復時間還有待進一步的研究。

5 結(jié) 論

本文提出了一種基于改性石墨烯敏感膜涂覆馬赫-曾德爾干涉結(jié)構(gòu)的光纖大腸桿菌傳感器，探究了它對大腸桿菌溶液的低濃度探測。結(jié)果表明：隨著大腸桿菌溶液濃度的增大，干涉光譜發(fā)生了明顯的藍移，在50～600 cfu/mL內(nèi)，傳感器的靈敏度為3.43 pm/(cfu·mL-1)，線性擬合度良好，線性擬合系數(shù)為0.956 49，檢測限為67.18 cfu/mL，響應時間為15 s。該傳感器具有體積小、制作簡單成本低、響應快等優(yōu)點，在低濃度大腸桿菌液檢測中具有潛在的應用價值。