于化新，馬 丹，劉旭東，劉慧慧，王凌志，王 路，單德紅，王德山

(遼寧中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院生理與心理教研室，沈陽 110847)

脾氣虛是中醫(yī)臨床常見證，以食少納呆、腹脹腹瀉、神疲乏力、身體消瘦等為主要癥狀，其中食少納呆、腹脹腹瀉癥狀的病理生理機制多認為與消化道神經-內分泌功能紊亂有關，但其中樞機制尚不清楚[1-4]?，F代醫(yī)學認為，下丘腦內存在攝食中樞、飽中樞和渴中樞，通過啟動和中止進食水沖動，控制消化道活動以維持機體能量穩(wěn)態(tài)。下丘腦神經元極為活躍，能量消耗巨大，當ATP不足時就需要膠質細胞內的糖原分解供能，否則將會引發(fā)消化道功能異常[5-6]。研究發(fā)現，膠質細胞內的糖原分解受多重因素影響，其中環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase, PKA)/磷酸化蛋白激酶(phosphorylase kinase, PhK)/糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase, GP)通路發(fā)揮重要作用[7-9]。脾氣虛的食少、腹脹是否與上述通路異常所導致的下丘腦供能不足有關，目前尚不清楚。為此，本研究通過觀察脾氣虛證模型大鼠24 h進食水量、胃腸蠕動和下丘腦cAMP-PKA-PhK-GP通路的變化，從糖原分解代謝角度探討下丘腦與脾氣虛食少納呆、腹脹腹瀉的關系，為闡明脾主運化功能的科學內涵提供依據。

1 材料

1.1 動物

16只SPF級雄性SD大鼠，體質量200±10 g，購于遼寧省本溪巿實驗動物中心(許可證號SCXK(遼)-2010-0001)，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心(許可證號SYXK(遼)-2013-000-9)。室溫18～23 ℃，相對濕度45%～55%，自由飲水進食，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。研究方案通過遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審核(批號20151205)。

1.2 儀器與試劑

iMark酶標儀和電泳儀(美國Bio-Rad公司)；高速冷凍離心機(美國Thermo Scientific)；顯影儀(上海天能科技有限公司，Tanon5200)。ATP和cAMP含量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20171107；20171115)；PKA含量測定試劑盒(北京全式金生物技術有限公司，批號K20103)；BCA法蛋白測定試劑盒(北京全式金生物技術有限公司，批號K20316)；PhK抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，批號00016933)；GP抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，批號00020262)；GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術有限公司，批號10003343)；HRP標記山羊抗兔二抗(北京全式金生物技術有限公司，批號K304223)；HRP標記山羊抗鼠二抗(武漢三鷹生物技術有限公司，批號20000002)；ECL化學發(fā)光試劑盒(北京全式金生物技術有限公司，批號K10419)。

2 方法

2.1 分組、模型復制及評價

大鼠按隨機數字表法分為正常組和脾氣虛證組(以下稱模型組)，正常組常規(guī)飼養(yǎng)，正常飲食水；模型組大鼠按文獻復合中醫(yī)病因方法[1,10]復制脾氣虛證模型，并按成模標準進行評價。即15 d內飽食1 d，禁食2 d，共5個循環(huán)，同時每日水溫35 ℃～37 ℃游泳至力竭。經評價未達成模標準者剔除，每組終極數為8只。

2.2 大鼠“食少”“腹脹”的評價

按文獻方法[11]，前者檢測大鼠24 h進食水量，即將大鼠單只放入代謝籠24 h后，計量投食/水量和剩余食/水量，二者差值即為其24 h進食水量；后者按1 ml/100 g 的比例灌服 10% 炭粉混懸液(阿拉伯膠和活性炭各占 10%)，30 min 后 10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔麻醉，開腹取胃和小腸，測量胃內炭末含量、小腸全長及小腸炭粉推進距離，分別計算炭末在胃內的殘留率和小腸推進率。

2.3 下丘腦糖原顆粒觀察

大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，快速開顱取下丘腦，將大部分-80 ℃凍存?zhèn)溆?，少部分? ℃下切成約1 mm3小塊，2.5%戊二醛固定，PBS漂洗，1%鋨酸固定，乙醇、丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋聚合，LKB-1型超薄切片機切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染，透射電鏡觀察高密度顆粒情況并拍片，檢測電壓120.0 kV。

2.4 下丘腦ATP、cAMP和PKA水平

采用ELISA法取凍存下丘腦制備組織勻漿，嚴格按照說明操作，分別檢測ATP、cAMP和PKA水平。

2.5 下丘腦PhK和GP表達

采用Western blot法。取凍存下丘腦，解凍后取20～40 mg組織加入200 μL裂解液，30 min后冰上研磨后置于無菌EP管，4 ℃下14000 r/min離心10 min取上清，BCA法測定蛋白濃度；每管加2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液100 μL，100 ℃變性，按50μg總蛋白上樣量計算加樣體積，SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜(25 V，2.5 A，30 min)，按Marker提示切膜標記；室溫5%脫脂奶粉/TBST封閉1 h后，分別加入PhK(1∶500)、GP(1∶500)和GAPDH(1∶2000)抗體各4 mL，4℃搖床過夜，TBST洗膜；PhK、GP盒內各加入4 mL HRP標記山羊抗兔二抗(1∶2000)，GAPDH盒內加入4 mL HRP標記山羊抗鼠二抗(1∶2000)，室溫搖床孵育1 h；TBST洗膜，加入ECL發(fā)光液曝光顯影。應用AlphaView SA軟件檢測相關蛋白的相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

實驗過程中沒有動物死亡及脫失現象。造模結束后，模型組大鼠出現消瘦、食少、神疲乏力和毛色枯槁無華等表現，表明脾氣虛證大鼠模型復制成功。

3.1 脾氣虛證大鼠的進食水量、胃殘留率和小腸推進率變化

表1顯示，與正常組比較，模型組大鼠的進食量、飲水量及小腸推進率下降(P<0.01，P<0.05，P<0.01)，但胃殘留率上升(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。

表1 脾氣虛證大鼠進食與胃腸功能變化比較

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01

3.2 脾氣虛證大鼠下丘腦糖原顆粒變化

圖1顯示，正常組和模型組均存在大量高密度顆粒(箭頭所示)，提示2組大鼠下丘腦內糖原均較多。

注：M.線粒體；N.細胞核圖1 透射電鏡觀察2組大鼠下丘腦糖原顆粒情況(25000×)

3.3 脾氣虛證大鼠下丘腦ATP及cAMP-PKA-PhK-GP通路相關指標變化

表2圖2顯示，與正常組比較，模型組大鼠下丘腦組織ATP、cAMP和PKA水平下降(P<0.01,P<0.01,P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義；Western blot法檢測結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠下丘腦組織PhK和GP表達光密度值下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。

表2 下丘腦ATP及cAMP-PKA-PhK-GP通路相關指標變化比較

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖2 脾氣虛證大鼠下丘腦PhK和GP表達比較

4 討論

大鼠脾氣虛證模型的復制方法較多。本研究采用中醫(yī)學復合病因造模更接近于脾氣虛證的形成機制，增加了模型的可信度。模型復制結果顯示，模型組大鼠的24 h進食水量明顯低于正常組，說明該組大鼠出現“食少”；模型組大鼠胃殘留率和小腸推進率分別顯著高于和低于正常組，表明該組大鼠出現“腹脹”，“食少”與“腹脹”作為脾氣虛的主要癥狀，其發(fā)生機制尚未進行研究。

現代醫(yī)學認為，進食水沖動和胃腸活動主要受控于下丘腦，因為下丘腦還在內分泌、體溫維持和情緒形成等方面具有重要作用，所以下丘腦能量消耗巨大。中樞神經元的能量源于血糖，不足時由儲存于星形膠質細胞內的糖原補充，其動員過程與神經元放電相偶聯。神經元興奮的基礎是Na+內流和K+外流，正常情況下神經元膜上的Na+-K+泵能夠將離子復位，維持膜內外正常的離子分布，但ATP不足將導致胞外高K+，如不及時干預則會導致神經元過度興奮。星形膠質細胞膜上也存在Na+-K+泵，能夠輔助神經元糾正胞外高K+，但因為與K+的親和力較低，其激活主要依靠胞內高Na+[12-13]。介導Na+內流的途徑較多，其中Na+-HCO3-同向轉運體在轉運Na+的同時，也運進大量的HCO3-，繼而激活腺苷酸環(huán)化酶，促進ATP分解為cAMP，從而提高PKA水平[14-15]。PhK是PKA的靶蛋白之一，其上調可激活GP，從而分解糖原[7,16]。脾氣虛時下丘腦cAMP-PKA- PhK-GP通路的變化目前還沒有報道。

研究結果顯示，模型組下丘腦組織中ATP水平明顯低于正常組，但電鏡結果卻顯示模型組與正常組的下丘腦內均存在大量糖原顆粒，表明脾氣虛狀態(tài)下，下丘腦神經元供能已然不足，但糖原儲備卻未見明顯減少，提示脾氣虛時下丘腦的糖原動員途徑可能出現障礙。進一步研究顯示，模型組下丘腦的cAMP和PKA水平明顯下降，PhK和GP表達顯著下調，表明下丘腦cAMP-PKA-PhK-GP通路抑制。由此推測，脾氣虛時下丘腦內的糖原無法及時分解供能，導致相關神經元因缺乏后續(xù)能量補充而出現功能紊亂，從而引發(fā)起機體不能正常進行消化吸收。因此本研究認為，脾氣虛食少納呆、腹脹等消化道功能改變，可能與cAMP-PKA-PhK-GP通路抑制所導致的下丘腦能量供給不足有關，下丘腦可能是調控脾主運化系統(tǒng)功能的中樞部位之一。