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        楊樹HDA902基因在低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的功能

        2020-04-08 09:20:20李開隆夏德安馬旭俊
        植物研究 2020年2期
        關(guān)鍵詞:乙?;?/a>脯氨酸轉(zhuǎn)基因

        關(guān) 韜 劉 超 李開隆 夏德安 馬旭俊

        (東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150040)

        環(huán)境溫度的季節(jié)性波動(dòng)影響植物生長(zhǎng)和發(fā)育的各個(gè)方面,嚴(yán)重限制植物的繁殖和地理分布[1]。在自然環(huán)境的溫度變化中,低溫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要條件[2]。在植物的整個(gè)成長(zhǎng)過程中,低溫會(huì)對(duì)其產(chǎn)生許多不利影響,在早期生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期尤為明顯。短期內(nèi)的溫度突然下降或低溫期的延長(zhǎng)將影響植物的光合作用,使植物的光能吸收效率和利用效率有所下降。植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育受其影響,導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降[3]。通過植物基因工程的方法改良植物是提高其低溫耐受能力的重要手段之一[4]。植物對(duì)壓力的反應(yīng)是生理、生化和結(jié)構(gòu)的變化,而許多基因的表達(dá)也會(huì)發(fā)生變化。在真核生物中,基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控在各種發(fā)育過程和應(yīng)激反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。其中一個(gè)重要的表觀遺傳調(diào)控是染色質(zhì)修飾[5]。

        組蛋白去乙?;?HDAC)在酵母、動(dòng)物和植物中廣泛存在,是一個(gè)超基因家族。根據(jù)植物與酵母HDAC序列的同源性比較,可以把植物HDAC分為RPD3/HDA1、SIR2和HD2三個(gè)亞家族。RPD3/HDA1亞家族成員的酶活性取決于細(xì)胞中是否含有Zn2+,屬于Zn2+依賴型組蛋白去乙?;?。植物在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中,隨著RPD3/HDA1亞家族基因表達(dá)水平的上調(diào)或下降,植物的表型也會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變[6~7]。該家族中的組蛋白去乙酰化酶參與調(diào)節(jié)植物在生物脅迫(病蟲害)和非生物脅迫(高鹽,干旱,低溫等)下的應(yīng)激反應(yīng)[8~11]。

        本實(shí)驗(yàn)室前期克隆了毛果楊組蛋白去乙?;窻PD3/HDA1亞家族基因HDA902[12]。表達(dá)分析表明,HDA902基因的表達(dá)受非生物脅迫的影響,低溫可誘導(dǎo)HDA902基因的表達(dá)[13]。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了植物過表達(dá)載體pROK Ⅱ-HDA902,并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)化到野生型煙草中,獲得轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)HDA902轉(zhuǎn)基因煙草耐低溫能力進(jìn)行分析,進(jìn)而明確HDA902在低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的功能。

        1 材料與方法

        1.1 植物表達(dá)載體構(gòu)建

        利用RT-PCR方法,從毛果楊葉片中克隆組蛋白去乙?;窻PD3/HDA1亞家族基因HDA902(XM_002313528)?;厥詹⒓兓疨CR擴(kuò)增片段,與載體pMDl9-T Vector連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,得到重組質(zhì)粒pMD19-HDA902并測(cè)序。對(duì)pMD19-HDA902和pROKⅡ空質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,使用的限制性核酸內(nèi)切酶為XbaⅠ和KpnⅠ。回收并純化目的片段,利用T4連接酶連接過夜,并通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。然后提取大腸桿菌質(zhì)粒用于雙酶切鑒定。植物表達(dá)載體通過熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,然后繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性單克隆菌落用于提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定,所需限制性核酸內(nèi)切酶為XbaⅠ和KpnⅠ。

        1.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

        利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。首先獲得煙草組織培養(yǎng)幼苗,用滅菌過的剪刀將葉片切成2 cm×2 cm大小的正方形。將煙草葉片浸沒于重組農(nóng)桿菌菌液中10 min,然后用吸水紙輕輕擦拭葉片,吸收多余的菌液。將侵染過和未侵染過的煙草葉片放在相同的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上,在室溫下進(jìn)行暗培養(yǎng)。將暗培養(yǎng)3 d后的煙草葉片轉(zhuǎn)移至含抗生素的篩選分化培養(yǎng)基上,而未侵染過的煙草葉片則置于不含抗生素的普通分化培養(yǎng)基上(作為對(duì)照),將少許未侵染過的葉片放于抗性篩選培養(yǎng)基中以驗(yàn)證抗生素是否失效。侵染后的葉片被放置在光周期為16 h光照/8 h黑暗,溫度為23~25℃的培養(yǎng)室中,定期更換抗性篩選培養(yǎng)基,每7天為1個(gè)周期,直到獲得轉(zhuǎn)基因煙草。

        1.3 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測(cè)

        提取野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的總RNA,然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit(Takara),將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照試劑盒說明,利用RT Primer Mix引物(含有Oligo dT Primer和Random 6 mers)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄時(shí),20 μL體系里使用的RNA量是1 000 ng。以野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的cDNA為模板,以GGCCTCCATCATGCTAAGAA作為HDA902基因的正向引物,以CAGAACACGCTCATGCACTT作為反向引物,進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)。在RT-PCR反應(yīng)中,以18S rRNA基因作為內(nèi)參照基因,其特異性引物序列為:正向引物TCAACTTTCGATGGTAGGATAGTG;反向引物CCGTGTCAGGATTGGGTAATTT。PCR(20 μL)反應(yīng)體系:2×Taq PCR StarMix with loading Dye 10 μL;ddH2O 7 μL;正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL;模板DNA(100 ng·μL-1)1 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,循環(huán)26次;72℃延伸10 min,16℃保溫。

        1.4 轉(zhuǎn)基因煙草的耐低溫能力分析

        選取野生型煙草WT-1和生長(zhǎng)狀態(tài)良好且轉(zhuǎn)基因表達(dá)量較高的HDA902轉(zhuǎn)基因煙草Tr-10、Tr-17株系(純系)作為低溫處理的植物材料。首先用75%乙醇清洗煙草種子,時(shí)間不超過30 s,然后用30%次氯酸鈉溶液對(duì)種子進(jìn)行5 min的消毒,消毒后用無(wú)菌蒸餾水清洗種子3~5次,最后將經(jīng)過消毒處理的種子均勻鋪在1/2 MS培養(yǎng)基上。經(jīng)4℃低溫春化2 d后,將種子放于25℃、16 h光照/8 h黑暗的環(huán)境下培養(yǎng)2周。當(dāng)煙草長(zhǎng)出第3、4片葉時(shí),進(jìn)行耐低溫能力分析。低溫處理時(shí),一批植株(包括WT,Tr-10和Tr-17)在植物培養(yǎng)室(23~25℃)培養(yǎng)2周,作為對(duì)照;另一批植株進(jìn)行低溫處理,即將煙草植株置于2℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)1周后再轉(zhuǎn)移至室溫環(huán)境下,繼續(xù)培養(yǎng)1周。3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。觀察和測(cè)量野生型和轉(zhuǎn)基因煙草在低溫脅迫下的生長(zhǎng)情況及生理指標(biāo)變化。用NBT和DAB這兩種染料對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因煙草的葉片進(jìn)行染色,以此分析低溫脅迫下HDA902基因?qū)煵莼钚匝醴e累起到的調(diào)控作用。

        此外,對(duì)4周齡的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行了低溫(2℃)處理,處理時(shí)間為0、1、2和3 d。然后,測(cè)定煙草葉片的丙二醛(MDA)和脯氨酸(Proline)含量。3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。

        1.5 丙二醛測(cè)定

        (1)取約0.1 g植物材料,液氮研磨后迅速稱取粉末質(zhì)量W,加入1.5 mL 10%三氯乙酸震蕩混勻,4℃放置30 min后,11 000×g離心20 min;

        (2)取上清液(即酶液)1 mL,加入1 mL 0.6% TBA,混勻后沸水浴反應(yīng)15 min;

        (3)冷卻至室溫,12 000×g離心20 min,吸取上清液分別測(cè)450和532 nm處的吸光值,所有樣品使用一個(gè)對(duì)照,即1 mL H2O加上1 mL 0.6% TBA。

        C(MDA濃度μmol·L-1)=6.45OD532-0.56OD450

        (1)

        計(jì)算每克樣品中丙二醛的含量(μmol·g-1):

        y=(C×V)/W

        (2)

        式中:V=1 mL。

        1.6 脯氨酸測(cè)定

        (1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,按照表1加入各種試劑,沸水浴反應(yīng)40 min。取出冷卻后,加入5 mL甲苯充分震蕩,靜置待分層。取甲苯層測(cè)520 nm處吸光值,以1號(hào)管為實(shí)驗(yàn)對(duì)照;

        表1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線所需藥劑及含量

        Table 1 Chemical agents and their contents of making standard curves

        藥劑Chemical agent1234567標(biāo)準(zhǔn)液Standard solution(mL)00.20.40.81.21.62水H2O(mL)21.81.61.20.80.40冰乙酸Aceticacid(mL)2222222顯色液Chromogenic agent(mL)3333333脯氨酸含量Proline content(μg)0248121620

        (2)取約0.1 g植物材料,液氮研磨后迅速稱取粉末質(zhì)量W,加入2 mL 3%磺基水楊酸溶液,震蕩混勻,于沸水浴中浸提10 min;

        (3)冷卻至室溫后,11 000×g離心5 min;

        (4)上清液1 mL+1 mL冰乙酸+1.5 mL顯色液,混勻后沸水浴反應(yīng)40 min;

        (5)取出冷卻后,加入2.5 mL甲苯充分震蕩,靜置待分層,取甲苯層測(cè)520 nm處吸光值,以1號(hào)管為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 植物表達(dá)載體構(gòu)建

        通過RT-PCR方法獲得HDA902基因片段(1 500 bp),經(jīng)過測(cè)序后克隆到pROKⅡ載體上,獲得pROKⅡ-HDA902重組載體并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105。利用限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切產(chǎn)物條帶大小與HDA902基因片段大小一致,進(jìn)而成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體(圖1)。

        圖1 重組質(zhì)粒pROKⅡ-HDA902的酶切鑒定 M. DNA Marker DL15000;1.HDA902基因片段的凝膠回收產(chǎn)物;2.pROKⅡ-HDA902重組質(zhì)粒的XbaⅠ和KpnⅠ酶切產(chǎn)物;3.pROKⅡ質(zhì)粒的XbaⅠ和KpnⅠ酶切產(chǎn)物Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pROKⅡ-HDA902 by enzyme digestion M. DL15000 Marker; 1. HDA902 gene fragment; 2. Recombinant plasmid pROKⅡ-HDA902 digested by XbaⅠ and KpnⅠ; 3. Plasmid pROKⅡ digested by XbaⅠ and KpnⅠ

        2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測(cè)

        對(duì)野生型和HDA902轉(zhuǎn)基因煙草株系進(jìn)行了半定量RT-PCR鑒定。結(jié)果顯示,野生型WT-1、WT-2和水(陰性對(duì)照)均沒有擴(kuò)增出特異性片段,而HDA902轉(zhuǎn)基因煙草各株系能夠擴(kuò)增出特異性片段(圖2),表明HDA902基因能夠在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)。

        圖2 HDA902轉(zhuǎn)基因煙草的RT-PCR鑒定 1. WT-1;2. WT-2;3~10.HDA902轉(zhuǎn)基因煙草株系;11.陰性對(duì)照(水)Fig.2 RT-PCR analysis of transgenic plants 1.WT-1; 2.WT-2; 3-10. HDA902 transgenic plants; 11.Negative control(ddH2O)

        圖3 低溫處理下野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草植株的生長(zhǎng)情況 A.野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株在室溫(對(duì)照)和低溫條件下的生長(zhǎng)情況(WT.野生型煙草;Tr-10,Tr-17.不同的轉(zhuǎn)基因株系); B.野生型和轉(zhuǎn)基因煙草植株在室溫(對(duì)照)和低溫條件下植株鮮重Fig.3 Growth of wild type and transgenic tobacco plants under the cold stress A. Growth of wild type and transgenic tobacco plants under room temperature(control) and cold stress(WT. Wild type tobacco; Tr-10,Tr-17. Different transgenic lines); B.Fresh weight of wild and transgenic tobacco plants under room temperature(control) and cold stress

        2.3 HDA902基因在低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的功能

        2.3.1 兩周齡植株的低溫耐受性分析

        在低溫耐受性分析中,選取2周齡植株進(jìn)行低溫(2℃)處理。經(jīng)過1周低溫處理,1周室溫恢復(fù)后,野生型和HDA902轉(zhuǎn)基因煙草的鮮重均有所增加,但轉(zhuǎn)基因煙草鮮重的增加量顯著高于野生型(圖3)。野生型低溫處理后鮮重增加了10%,而轉(zhuǎn)基因株系Tr-10和Tr-17的鮮重分別增加了28%和38%。這說明HDA902基因在煙草中的表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)低溫的耐受性,促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因煙草在低溫脅迫條件下的生長(zhǎng)。

        2.3.2 四周齡煙草低溫耐受性分析

        在植物中,脯氨酸(Pro)含量的增加通常表明植物正處于不利于生長(zhǎng)發(fā)育的逆境中,而丙二醇(MDA)含量的高低則顯示膜系統(tǒng)是否受到傷害以及受損程度的大小。將4周齡野生型和HDA902轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行低溫(2℃)處理,并分析轉(zhuǎn)基因煙草的低溫耐受性。低溫處理24 h時(shí),野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片MDA含量均增加,野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草之間無(wú)顯著差異;而野生型煙草的Pro含量低于轉(zhuǎn)基因煙草。隨著時(shí)間的增加,轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草之間的MDA和Pro含量在低溫處理72 h后呈現(xiàn)明顯差異,轉(zhuǎn)基因煙草的MDA含量顯著低于野生型,而Pro含量顯著高于野生型(圖5)。這些結(jié)果表明,HDA902通過影響MDA和脯氨酸的含量來(lái)提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)低溫的耐受性。

        圖4 低溫處理下野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草葉片H2O2和的積累 A.NBT染色(WT.野生型煙草;Tr-10,Tr-17.不同的轉(zhuǎn)基因株系);B. DAB染色Fig.4 The accumulation of H2O2 and in the leaves of wild type and transgenic tobacco after cold treatment A. NBT staining results(WT. Wild-type tobacco; Tr-10,Tr-17. Different transgenic lines); B. DAB staining results

        圖5 低溫處理下野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草葉片丙二醛和脯氨酸的含量 A.MDA含量(WT.野生型煙草;Tr-10和Tr-17.不同的轉(zhuǎn)基因株系);B.脯氨酸含量Fig.5 Contents of MDA and Proline in wild type and transgenic tobacco leaves after cold treatment A. Contents of MDA(WT. Wild type tobacco; Tr-10,Tr-17. Different transgenic lines); B. Contents of proline

        3 討論

        在植物中,組蛋白去乙酰化酶(HDAC)是一個(gè)超基因家族。目前,關(guān)于植物HDAC的研究越來(lái)越多,大多數(shù)都集中在HDAC在發(fā)育過程中的作用,HDAC在脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的作用研究相對(duì)較少。雖然研究相對(duì)較少,但在草本植物和農(nóng)作物中的研究表明,組蛋白去乙?;冈诿{迫應(yīng)答反應(yīng)中起著重要的調(diào)控作用,不同HDAC成員在脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的作用不同[14~17]。Chen[14]等研究顯示,HDAC家族中的Ⅰ類酶(HDA19)酶活性被HDAC抑制劑抑制后,植株的耐鹽性提高。在擬南芥中,HDA6和HDA19在鹽和ABA[14]作用下對(duì)種子萌發(fā)起正調(diào)節(jié)作用,而HDA19對(duì)種子萌發(fā)和幼苗根系生長(zhǎng)過程中鹽和干旱脅迫耐受性起負(fù)調(diào)節(jié)作用[18]。在木本植物中,對(duì)HDAC的研究鮮有報(bào)道。

        本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道了楊樹RPD3/HDA1類型組蛋白去乙?;?4KHDA903在干旱脅迫反應(yīng)中的作用。84KHDA903顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性[19]。與鹽和干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)研究相比,植物HDAC在響應(yīng)低溫脅迫時(shí)的功能研究相對(duì)較少。To等[9]研究發(fā)現(xiàn),擬南芥HDA6基因的表達(dá)量在低溫處理72 h后明顯增加,說明組蛋白去?;富騂DA6參與低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)。Hu等[20]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)玉米植株從室溫轉(zhuǎn)移至低溫后,HDAC103、HDAC106、HDAC108和HDAC110這4個(gè)基因表達(dá)水平呈現(xiàn)出迅速提高的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn),毛果楊HDAC家族中大部分基因的表達(dá)受低溫誘導(dǎo)[21],而毛果楊HDAC基因在低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的功能還不清楚。

        本研究首次解析了木本植物HDAC在低溫脅迫中的功能。發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下,HDA902轉(zhuǎn)基因煙草會(huì)產(chǎn)生較少的活性氧,葉片丙二醛(MDA)含量較低,而脯氨酸含量較高。這些研究結(jié)果表明,毛果楊HDA902參與調(diào)控植物對(duì)低溫脅迫的耐受性,而具體的調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

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