楊 媛，周鑫蓓，劉宛書，金會(huì)艷

(昆明醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

鄰苯二甲酸二乙基己酯(Di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP) 是目前用量較大的鄰苯二甲酸酯類化合物(PAE)的重要成員，主要應(yīng)用于各種塑料產(chǎn)品如纖維素樹脂、聚乙烯和聚氯乙烯食品包裝材料，醫(yī)用材料和兒童玩具的生產(chǎn)加工[1]。由于在塑膜加工過程中，DEHP并未與PVC塑膜以共價(jià)化學(xué)鍵結(jié)合，因此，隨著時(shí)間的推移，它很容易從塑料中轉(zhuǎn)移至外環(huán)境，從而污染空氣、水體、以及土壤[1]。由于其產(chǎn)量巨大并且可以通過進(jìn)食、飲水、呼吸以及皮膚接觸進(jìn)入人體，因此，目前其生理學(xué)毒性備受全球環(huán)境醫(yī)學(xué)研究者關(guān)注[2]。

DEHP是一種公認(rèn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，具有擬雌激素、抗雄激素活性的性質(zhì)，可干擾人體內(nèi)源性激素的分泌，因而對(duì)人和動(dòng)物產(chǎn)生多方面不利影響，其中研究廣泛是其生殖發(fā)育毒性[3]。近年來的研究顯示暴露在DEHP環(huán)境中對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)也有一定的毒害作用。DEHP暴露引起神經(jīng)管畸形、露腦畸形和通過芳香化酶影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能[4]。雖然DEHP對(duì)于動(dòng)物認(rèn)知行為的影響已經(jīng)被人們初步認(rèn)識(shí)，但是對(duì)其研究多集中于妊娠期和圍產(chǎn)期DEHP暴露對(duì)子鼠認(rèn)知行為的影響[5]，而青春期DEHP暴露對(duì)大鼠神經(jīng)行為的影響的研究較少,且研究結(jié)果也不一致。王冬的研究發(fā)現(xiàn)，青春前期暴露于DEHP的雄性大鼠產(chǎn)生焦慮樣和抑郁樣行為[6]。DEHP暴露還可損傷青春期雄鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)探討了青春期暴露于不同劑量DEHP對(duì)成年大鼠神經(jīng)行為的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生后21 d的SD雄性大鼠，24只，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水，室內(nèi)溫度 23～25℃，相對(duì)濕度60%～70%，維持12 h光照/12 h黑暗的晝夜節(jié)律，實(shí)驗(yàn)符合相關(guān)倫理學(xué)要求。

1.2 儀器

動(dòng)物行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)(Smart 3.0，西班牙)，紅外視頻恐懼系統(tǒng)(MED associates，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

幼鼠隨機(jī)分為3組：溶劑對(duì)照組(玉米油)，中濃度組(50 mg/kg)，高濃度組(500 mg/kg)，每組各8只。連續(xù)2周對(duì)幼鼠進(jìn)行灌胃處理，達(dá)到8周齡后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。

1.3.1 開放場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)前，提前將大鼠放入實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)2 h。開放場(chǎng)尺寸為40 cm×40 cm×35 cm(長(zhǎng)×寬×高)的箱子，讓大鼠在箱內(nèi)自由運(yùn)動(dòng)6 min，分析后5 min內(nèi)的自發(fā)活動(dòng)。

1.3.2 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠頭朝開臂放入迷宮中央?yún)^(qū)，同時(shí)開啟攝像記錄下大鼠5 min內(nèi)進(jìn)入開臂次數(shù)及進(jìn)入開臂的時(shí)間。

1.3.3 強(qiáng)迫游泳測(cè)試

大鼠放入透明玻璃圓缸中，溫度控制在25℃。第一天將大鼠放入水中訓(xùn)練15 min，拿出大鼠用毛巾擦干后放回鼠籠。第二天同樣的條件下游泳6 min，記錄6 min中內(nèi)后5 min大鼠不動(dòng)的時(shí)間。判斷不動(dòng)是指大鼠基本不做主動(dòng)的活動(dòng)，僅在必要的時(shí)候用后肢碰觸底面避免窒息。

1.3.4 背景條件恐懼實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)在特定的操作箱內(nèi)進(jìn)行(MED associates,St,Albans,VT)。第一天進(jìn)行背景條件化恐懼記憶的訓(xùn)練，將大鼠放在操作箱內(nèi)，讓其自由探索2 min，然后給與5 次足部電擊，電擊間隔時(shí)間為2 min，每次電擊的強(qiáng)度為0.8 mA，持續(xù)時(shí)間為2 s。最后一次電擊結(jié)束后2 min將大鼠拿回飼養(yǎng)籠。記錄訓(xùn)練過程中大鼠每次電擊后2 min內(nèi)的僵立時(shí)間，判定標(biāo)準(zhǔn)為除了呼吸和緩慢的鐘擺式動(dòng)作其他所有動(dòng)作停止并持續(xù)2 s以上。24 h后，進(jìn)行背景條件恐懼記憶的提取，大鼠放回恐懼訓(xùn)練箱中，不給足部電擊，記錄大鼠在4 min內(nèi)的僵立時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示?？謶钟洃洔y(cè)試的數(shù)據(jù)用重復(fù)測(cè)量雙因素方差分析(repeated measure two-way ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn)。其余數(shù)據(jù)用Student's T-test 進(jìn)行檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19，當(dāng)P<0.05 認(rèn)為有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 青春期DEHP暴露對(duì)成年大鼠焦慮樣行為的影響

首先在開放場(chǎng)中測(cè)試動(dòng)物在新穎環(huán)境中的探索和活動(dòng)性。如圖1所示,青春期DEHP暴露，中濃度組(50 mg/kg)和高濃度組(500 mg/kg)在開放場(chǎng)中的總的活動(dòng)距離(Distance moved)與對(duì)照組相比有所增加，但無顯著性差異(P >0.05)，表明青春期DEHP暴露對(duì)成年大鼠的活動(dòng)性沒有明顯影響。

(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，*P < 0.05，與正常對(duì)照組比較)

如圖2所示，在高架十字迷宮測(cè)試中，青春期DEHP暴露，中濃度組(50 mg/kg)和高濃度組(500 mg/kg)大鼠在開臂的時(shí)間(Time spent in open arms)和開臂的總次數(shù)(Entries in open arms)與正常對(duì)照組相比，差異均無顯著性(P>0.05)。

(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，*P < 0.05，與正常對(duì)照組比較)

圖2 青春期DEHP暴露對(duì)高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的影響

2.2 青春期DEHP暴露對(duì)大鼠強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的影響

(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，*P < 0.05，與正常對(duì)照組比較)

如圖3所示，青春期 DEHP暴露中濃度組(50 mg/kg)與正常對(duì)照組比較強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間(Immobility time)有所縮短，但無顯著性差異(P>0.05)。高濃度組(500 mg/kg)與正常對(duì)照組比較強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間縮短，有顯著差異(P <0.05)。表明青春期DEHP暴露影響成年大鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)性。

2.3 青春期DEHP暴露對(duì)大鼠背景條件恐懼實(shí)驗(yàn)的影響

如圖4所示，青春期DEHP暴露，中濃度組(50 mg/kg)和高濃度組(500 mg/kg)及正常對(duì)照組都表現(xiàn)出較好的習(xí)得背景環(huán)境依賴的恐懼，隨著訓(xùn)練的進(jìn)行表現(xiàn)出不斷增強(qiáng)的恐懼行為，但沒有明顯的組間效應(yīng)(P >0.05)，說明DEHP暴露和正常對(duì)照組相比，背景條件化恐懼記憶的學(xué)習(xí)沒有差異。

(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，*P < 0.05，與正常對(duì)照組比較)

圖4 青春期DEHP暴露對(duì)大鼠恐懼記憶的影響

第二天提取，DEHP暴露中濃度組(50 mg/kg)與正常對(duì)照組比較僵立時(shí)間(Freezing %)無明顯變化(P>0.05)，但高濃度組(500 mg/kg)與正常對(duì)照組比較僵立時(shí)間縮短(P <0.05)。表明青春期DEHP暴露影響成年大鼠在背景條件恐懼記憶的提取。

3 討論

青春期是腦發(fā)育和動(dòng)物神經(jīng)行為形成的又一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期，此時(shí)腦內(nèi)的性激素水平對(duì)行為性別分化起關(guān)鍵作用。因此，在此時(shí)期極易受到內(nèi)分泌干擾物DEHP的影響。目前對(duì)青春期DEHP暴露對(duì)大鼠神經(jīng)行為的影響的研究較少，且研究結(jié)果也不一致。本研究通過幾種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了青春期DEHP暴露對(duì)成年大鼠多種行為的影響，發(fā)現(xiàn)DEHP暴露不影響大鼠的活動(dòng)性和焦慮樣行為，但高濃度DEHP暴露影響大鼠在強(qiáng)迫游泳中的活動(dòng)性。同時(shí)高濃度DEHP暴露損傷了大鼠背景條件恐懼記憶。