姜 浩，楊寶山，王 惠，曹鑫磊，高永超，吳慶通

(1.濟(jì)南大學(xué) 水利與環(huán)境學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022； 2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生態(tài)研究所 山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250013)

納米ZnO(ZnONPs)作為常見的納米材料之一，因其具有傳統(tǒng)大顆粒ZnO的特性和其自身獨(dú)特的納米特性[1-2]，在催化劑、化妝品和紡織品等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[3-5]。ZnONPs的廣泛生產(chǎn)和應(yīng)用增加了其在環(huán)境中的大量釋放[4-5]。ZnONPs作為一類重要的無機(jī)納米材料，已有學(xué)者指出，其對(duì)土壤微生物的毒性比有機(jī)納米顆粒更大[6]。此外，這些金屬氧化物納米顆粒還可通過對(duì)微生物代謝的毒性作用，影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)[7]。

還田秸稈是土壤中有機(jī)質(zhì)和土壤養(yǎng)分的主要來源之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來小麥秸稈的產(chǎn)量每年達(dá)到1.54×108～1.85×108t[8]，通過秸稈還田對(duì)其進(jìn)行處理，是減少環(huán)境污染，增加土壤有機(jī)碳含量的重要途徑[9-10]。土壤呼吸是土壤碳素排放到大氣的主要途徑[11]，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中土壤碳排放的一個(gè)重要組成部分[12]。納米顆粒在土壤中的大量積累可能會(huì)對(duì)土壤呼吸及相應(yīng)的微生物活性產(chǎn)生影響。但關(guān)于秸稈還田條件下ZnONPs對(duì)土壤呼吸作用影響的研究，目前還未見開展。因此，開展ZnONPs對(duì)小麥秸稈還田后土壤呼吸的影響的研究，探明ZnONPs對(duì)土壤碳循環(huán)過程的影響，分析其影響因素，對(duì)ZnONPs環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

ZnONPs購(gòu)自北京博宇高科新材料技術(shù)有限公司，淡黃色粉末，純度為99.9%，平均粒徑約14.6 nm，比表面積為51.5 m2/g。

小麥秸稈采自當(dāng)?shù)厥崭詈蟮男迈r小麥，帶回實(shí)驗(yàn)室后風(fēng)干并粉碎至2 cm以下。

1.1.2 土壤采集

土壤樣品于2018年3月采自山東省濟(jì)南市章丘區(qū)(117°23′31.11″E，36°40′5.23″N)冬小麥-夏玉米輪作農(nóng)田土壤，土壤類型為潮土，取樣深度為0 ～ 20 cm。土壤樣品采集后迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，去除可見根系、有機(jī)碎屑和石頭等，將新鮮土樣充分混勻后過2 mm篩，并測(cè)定土壤基本理化性質(zhì)：pH值為7.35，w(含水量)為10.13%，w(有機(jī)質(zhì))為1.66%，w(銨態(tài)氮)為8.03 mg/kg，w(硝態(tài)氮)為6.18 mg/kg，w(總氮)為0.83 g/kg，備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為穩(wěn)定土壤微生物活性，在試驗(yàn)開始前將供試土壤在(25 ± 3)℃，黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2周，期間調(diào)節(jié)土壤含水量為最大持水量(w)的50%[13]。試驗(yàn)設(shè)無任何添加的處理(CS)，秸稈還田處理(5 g/kg)[14](SW)和秸稈還田(5 g/kg)并添加ZnONPs(500 mg/kg)[12]3個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。

將預(yù)培養(yǎng)的土壤分裝于9個(gè)2.5 L的廣口瓶底部，每個(gè)瓶中裝相當(dāng)于50 g干重的土壤，將ZnONPs和小麥秸稈均勻混合于土壤中，調(diào)節(jié)土壤含水量至最大持水量的50%，內(nèi)置裝有25 mL NaOH(0.1 mol/L)溶液的50 mL燒杯，蓋上瓶塞，用真空硅脂密封。廣口瓶置于溫室中，溫度保持在(25 ± 3)℃、黑暗條件下進(jìn)行室內(nèi)礦化實(shí)驗(yàn)，分別在第2、4、7、14、21、28、42、56天取出燒杯。用0.05 mol/L HCl反滴定法確定CO2釋放量，計(jì)算CO2累積排放量[15]。分別在第7、14、56天進(jìn)行破壞性取樣，存于4℃冰箱，用于進(jìn)行土壤酶活性、土壤理化性質(zhì)和微生物生物量的測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤pH值的測(cè)定

土壤pH值選用水土比2.5∶1(V/m)采用酸度計(jì)測(cè)定[4]。

1.3.2 土壤酶活性測(cè)定

土壤過氧化物酶的測(cè)定采用鄰苯三酚比色法[16]，其活性以每克土壤2 h內(nèi)生成焦性沒食子酸的毫克數(shù)來表示；土壤纖維二糖水解酶的測(cè)定由上海通蔚生物科技有限公司利用試劑盒完成，其單位為每克土壤消耗國(guó)際單位酶量；β-葡萄糖苷酶的測(cè)定采用硝基酚比色法[17]，其活性以每克土壤1 h產(chǎn)生的對(duì)-硝基酚的微克數(shù)表示。

1.3.3 土壤MBC和微生物吸收Zn2+數(shù)量測(cè)定

土壤MBC的測(cè)定采用氯仿熏蒸-硫酸鉀提取的方法[4]。微生物中Zn2+含量的測(cè)定采用氯仿熏蒸-硝酸銨提取的方法[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZnONPs對(duì)土壤呼吸的影響

ZnONPs改變了小麥秸稈還田土壤中CO2的釋放(圖1)。從第4 d開始，秸稈添加處理中CO2的釋放均顯著高于對(duì)照組，且隨著天數(shù)增加，差異性越明顯。與SW處理相比，ZnONPs添加后CO2的釋放在整個(gè)培養(yǎng)過程中都被抑制，但土壤呼吸作用釋放的CO2顯著高于對(duì)照。在56 d前，SW與SWZ處理間無顯著差異?？梢?，在培養(yǎng)期間，加入小麥秸稈后土壤呼吸作用顯著提高，但在ZnONPs處理中CO2的釋放明顯降低，表明ZnONPs對(duì)添加小麥秸稈后的土壤呼吸具有一定的抑制作用。當(dāng)ZnONPs暴露于土壤中時(shí)，對(duì)ZnONPs敏感的微生物會(huì)受到抑制，這可能是ZnONPs進(jìn)入土壤后呼吸速率下降的原因[15]。

圖1 三種處理?xiàng)l件下CO2釋放量的變化

2.2 ZnONPs對(duì)土壤酶活性的影響

圖2 ZnONPs和小麥秸稈對(duì)過氧化物酶(A)，纖維二糖水解酶(B)和β-葡萄糖苷酶(C)的影響

在添加ZnONPs和小麥秸稈的條件下，3種土壤酶活性產(chǎn)生不同的變化(圖2A,2B和2C)。第7 d時(shí)，過氧化物酶活性在秸稈處理下最高，ZnONPs添加后其活性降低，而在14 d和56 d后，過氧化物酶活性在各處理間無顯著差異(圖2A)。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，添加秸稈的處理組中纖維二糖水解酶的活性顯著升高；其中，ZnONPs處理下的纖維二糖水解酶活性在第7 d和56 d顯著低于秸稈添加處理，但在第14 d時(shí)無顯著差異(圖2B)。過氧化物酶和纖維二糖水解酶的活性均隨著培養(yǎng)天數(shù)升高而增加。可見，ZnONPs對(duì)過氧化物酶和纖維二糖水解酶的抑制效果較為顯著。重金屬可以與巰基反應(yīng)形成金屬巰蛋白，從而使酶失去活性或受到抑制[18]。在7 d和14 d后，雖然ZnONPs對(duì)β-葡萄糖苷酶活性存在抑制作用，但沒有顯著差異，而在實(shí)驗(yàn)過程的最后階段(56 d)，在添加ZnONPs的處理中，β-葡萄糖苷酶活性顯著高于對(duì)照組(圖2C)。此外，β-葡萄糖苷酶活性隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加有略微降低。纖維素是秸稈中易分解的不穩(wěn)定的成分，通常比木質(zhì)素降解的更快[19]，這可能是其隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而降低的主要原因。

2.3 ZnONPs對(duì)pH值和微生物中Zn2+含量的影響

如表1所示，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，SW處理的pH值均略低于CK和SWZ處理。在第7 d，SWZ相較于SW顯著提高了3.9%；然而14 d后，SW比對(duì)照組降低了3.1%，而SWZ比SW的pH值提高了3.6%；培養(yǎng)56 d后，SW與對(duì)照組相比降低了1.7%。可見，小麥秸稈添加后，土壤pH值降低，表明外源有機(jī)質(zhì)的添加可影響土壤化學(xué)性質(zhì)；而添加ZnONPs土壤的pH值與對(duì)照相比無顯著差異，表明ZnONPs的暴露抑制了有機(jī)質(zhì)的分解。事實(shí)上，小麥秸稈的分解增加了CO2釋放，是土壤pH值降低的可能原因之一。植物殘?bào)w富含木質(zhì)素、纖維素和酚類化合物，分解后會(huì)在土壤中產(chǎn)生有機(jī)酸，也可能導(dǎo)致土壤pH值的降低[15]。此外，SWZ處理的微生物中Zn2+的濃度是對(duì)照組的3.4倍，表明ZnONPs添加后釋放的Zn2+可被微生物吸收。

表1 ZnONPs和小麥秸稈對(duì)土壤pH值和微生物中Zn2+的影響

2.4 ZnONPs對(duì)MBC的影響

如圖3所示，添加秸稈和ZnONPs后，同一天數(shù)不同處理之間及同一處理不同培養(yǎng)天數(shù)之間的土壤微生物量碳含量均不存在顯著差異。然而，Rashid等[33]發(fā)現(xiàn)，高濃度氧化鐵納米顆粒(2000 mg/kg)降低了MBC。由此可見，MBC的變化與NPs的劑量和種類有關(guān)，本研究中，ZnONPs在500 mg/kg濃度下，對(duì)土壤微生物量影響較小。

圖3 ZnONPs和小麥秸稈對(duì)微生物生物量碳的影響

3 研究結(jié)論

(1)小麥秸稈的添加增強(qiáng)了土壤呼吸作用及過氧化物酶、纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶活性，顯著促進(jìn)了土壤中的碳循環(huán)過程。

(2)ZnONPs對(duì)土壤呼吸和纖維二糖水解酶具有抑制作用，抑制作用的大小隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。ZnONPs添加后，微生物中Zn2+的含量顯著增加。