郭雅麗，王 易，張 邈，程玉蕾，張德娥，李佳藝，肖 莉

(湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

瑪咖有“秘魯人參”之稱，是一種傳統(tǒng)的藥食兩用型植物，目前在我國(guó)云南地區(qū)廣泛種植[1]。臨床藥理研究結(jié)果顯示，瑪咖富含生物堿、瑪咖酰胺、瑪咖烯、黃酮、多糖等次生代謝產(chǎn)物，具有改善性功能、抗疲勞、抗氧化等功效，藥用價(jià)值較高，受到人們的廣泛關(guān)注[2-4]。目前對(duì)瑪咖中活性成分的研究主要集中于瑪咖酰胺、瑪咖烯及多糖等，對(duì)瑪咖中黃酮成分的研究則較少。本研究以瑪咖總黃酮為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)超聲波輔助提取瑪咖總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為瑪咖總黃酮源的綜合利用提供參考[5-6]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

電子分析天平，Mettler Tlledo；756CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科；高速多功能粉碎機(jī)，上海舍巖；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮；抽濾真空泵，鄭州長(zhǎng)城；超聲波清洗器，上海閣凌。

1.2 試藥

瑪咖原粉，產(chǎn)自云南，曬干后加工為瑪咖粉；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：F20171108；無(wú)水乙醇、95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 瑪咖總黃酮的測(cè)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

精密稱取一定量的蘆丁對(duì)照品置于50 mL容量瓶中，加入適量95%乙醇超聲處理使溶解后，續(xù)加95%乙醇稀釋定容至刻度，搖勻，得到0.200 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液備用。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL置于10 mL容量瓶中，依據(jù)顯色條件依次加入亞硝酸鈉溶液、硝酸鋁溶液、氫氧化鈉溶液，并在510 nm波長(zhǎng)處依次測(cè)定吸光度，得到線性回歸方程為：A=5.0378C-0.011，R2= 0.9968，表明在0.04～0.14 mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度線性關(guān)系良好。

2.1.3 總黃酮含量的測(cè)定

精密吸取一定量的瑪咖提取液，按2.1.3項(xiàng)方法測(cè)定吸光度，代入回歸方程，計(jì)算得到瑪咖總黃酮含量，根據(jù)下述公式，計(jì)算得瑪咖總黃酮提取率。

C為提取液中瑪咖總黃酮濃度(mg/mL)，V為提取液體積(mL)，M為瑪咖藥材粉末投料量(g)。

2.2 單因素考察

2.2.1 乙醇濃度

精密稱取瑪咖粉末10.00 g，固定料液比為1∶7，超聲時(shí)間為30 min，考察在40%、50%、60%、70%、80%乙醇濃度條件下總黃酮的提取率。

2.2.2 料液比

密稱取瑪咖粉10.00 g，固定乙醇濃度為60%，超聲時(shí)間30 min，分別考察在料液比(g/mL) 為1∶5、1∶7、1∶9、1∶11、1∶13的條件下總黃酮的提取率。

2.2.3 提取次數(shù)

密稱取瑪咖粉末10.00 g，固定乙醇濃度為60%，料液比為1∶7，超聲時(shí)間為30 min，考察提取次數(shù)為1次、2次、3次時(shí)總黃酮的提取率。

2.2.4 提取時(shí)間

精密稱取瑪咖粉末10.00 g，固定乙醇濃度為60%，料液比為1∶7，考察分別在超聲時(shí)間10、20、30、40、50 min 條件下總黃酮的提取率。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

單因素試驗(yàn)的結(jié)果，只能得到單因素對(duì)提取率的影響，無(wú)法獲得單因素之間的交互作用結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理，選擇乙醇濃度(A)、料液比(B)及提取時(shí)間(C)3個(gè)影響因素為自變量，以瑪咖總黃酮提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素5水平響應(yīng)面分析方法優(yōu)化提取工藝，采用Design-Expert v8.0進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果分析。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間及提取次數(shù)對(duì)瑪咖總黃酮提取率的影響

Fig.1 Effect of ethanol,material-liquid ratio,extraction time,frequency on extraction rate of flavonoids from Maca

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖可知，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)測(cè)得瑪咖總黃酮提取率最高，這可能是由于瑪咖黃酮中主要成分為中等極性的黃酮苷類物質(zhì)，隨著提取溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，體系的極性下降，從而降低了黃酮苷類物質(zhì)的溶出。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，瑪咖總黃酮的提取率出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，瑪咖總黃酮提取率達(dá)到最高值0.58%。這是由于隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，瑪咖總黃酮逐漸達(dá)到溶出平衡，超過(guò)30 min時(shí)，瑪咖中雜質(zhì)成分的溶出也隨之增加，從而干擾瑪咖總黃酮的測(cè)定。當(dāng)料液比達(dá)到1∶7時(shí)，瑪咖總黃酮提取率達(dá)到最高值。究其原因，可能是由于此時(shí)瑪咖中的黃酮成分已基本溶出完全，進(jìn)一步提高料液比也無(wú)法提高提取率，從而造成溶劑的浪費(fèi)?，斂Э傸S酮提取率雖然隨提取次數(shù)的增加有所升高，但升高并不明顯，從實(shí)驗(yàn)效果與成本等多方面考慮，因此確定最佳提取次數(shù)為1次。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化的各自變量范圍為：乙醇濃度50%～70%，超聲時(shí)間20～40 min，料液比1∶5～1∶9。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝結(jié)果

采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)瑪咖總黃酮提取實(shí)驗(yàn)安排及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 星點(diǎn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以瑪咖總黃酮提取率為指標(biāo)(R1)，采用Design-expert8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合，得到的回歸方程為：

R1=0.98-0.13A-0.056B+0.028C+0.051AB-0.026AC+0.011BC-0.19A2-0.082B2-0.19C2

表3 回歸模型方差分析

注: *P<0.05;＊＊P<0.01;＊＊＊P<0.001

3.3 交互作用對(duì)瑪咖總黃酮提取率的影響

相對(duì)于三個(gè)單因素其中兩個(gè)因素，通過(guò)Design-expert軟件繪制三維響應(yīng)面圖，進(jìn)一步分析各因素交互作用對(duì)瑪咖總黃酮提取率的影響。響應(yīng)面的平緩程度，直觀地反映了各自變量發(fā)生變化時(shí)瑪咖總黃酮提取率的響應(yīng)靈敏程度。

圖2 兩因素交互作用對(duì)瑪咖總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖

圖2中的三維效應(yīng)面圖可以反映出乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)和溶劑倍數(shù)(C)的交互作用對(duì)瑪咖總黃酮提取率的影響。AB、AC、BC的曲面坡度均較為平緩，故其對(duì)瑪咖總黃酮提取率的影響不顯著，與方差分析的結(jié)果一致。

3.4 最優(yōu)方案的驗(yàn)證

設(shè)置瑪咖總黃酮提取率目標(biāo)值為最大值，通過(guò)Design-Expert 軟件分析出最佳提取工藝為：乙醇濃度57.58%，提取時(shí)間27.35 min，料液比1∶7.10，60℃下提取1次，瑪咖總黃酮理論提取率為1.01%。按此工藝平行實(shí)驗(yàn)三次，得到的瑪卡總黃酮平均提取率為0.99%，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值差別不大，說(shuō)明該工藝穩(wěn)定可靠。

4 結(jié)論

本研究采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法，可以直觀反映出各個(gè)因素對(duì)瑪咖總黃酮提取率的影響。二項(xiàng)式擬合結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)R為0.9763，說(shuō)明本次建立的擬合模型較為成功，預(yù)測(cè)性良好。獲得最佳提取條件為：乙醇濃度57.58%，提取時(shí)間27.35 min，料液比1∶7.10，60℃下提取1次，在此條件下瑪咖總黃酮提取率為0.99%，為瑪卡總黃酮的提取應(yīng)用提供一定的參考。