夏 峰

(南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院，江蘇 連云港 222000)

酶催化具有高效、專一、作用條件溫和及環(huán)境友好等顯著特點，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品、輕工和環(huán)境保護(hù)等行業(yè)[1]。雖然酶具有如此優(yōu)越的性能，但游離酶穩(wěn)定性差、不易分離、難于回收，因而其應(yīng)用受到一定限制，而酶的固定化可以很好的解決這一問題，使其具有更廣闊的應(yīng)用空間[2-4]。漆酶是含有四個銅離子的多酚氧化酶，屬單電子氧化還原酶，來源廣泛，具有相當(dāng)寬泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于生物漂白、廢水處理、有機合成、燃料電池、生物傳感器構(gòu)建和藥物生產(chǎn)等方面[5-8]。SBA-15是一種水熱穩(wěn)定性高，孔徑大的介孔材料，對于固定大分子的酶具有一定優(yōu)勢[9-10]。本文以大孔徑SBA-15為載體，通過吸附漆酶制備了一種固定化漆酶，該固定化漆酶表現(xiàn)出良好的操作穩(wěn)定性，具有一定應(yīng)用價值。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

pH計，準(zhǔn)微量天平，水平搖床，離心機，Biomate 3S紫外分光光度計。

1.2 試劑

磷酸二氫鈉·二水，磷酸氫二鈉·十二水，2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(以下簡稱ABTS)，漆酶，SBA-15分子篩。

2 實驗方法

2.1 漆酶的固定化

將0.05 g的SBA-15(BET比表面積≥800 m2/g，孔徑 6～10 nm)分子篩懸浮于5 mL含有一定濃度漆酶的0.2 mol/L磷酸緩沖液中，在水平搖床上以160 r/min的轉(zhuǎn)速反應(yīng)20 h，然后離心分離出固體，并用磷酸緩沖液洗滌固體至上清液中檢測不到酶活，即得到需要的固定化漆酶。

2.2 酶活性的測定

游離漆酶活性的測定：以1.0 mmol/L的ABTS溶液為底物，取一定濃度的漆酶溶液與ABTS溶液進(jìn)行等體積反應(yīng)，反應(yīng)體系為適當(dāng)pH值的0.2 mol/L磷酸緩沖液，然后用Biomate 3S紫外分光光度計測定反應(yīng)體系4 min內(nèi)420 nm處的吸光度變化，吸光度變化越大，酶活越高，每分鐘使1 μmol的ABTS氧化所需的酶量定義為一個酶活單位。

固定化漆酶活性的測定：取0.05 g固定化漆酶，加入2 mL適當(dāng)pH值的0.2 mol/L磷酸緩沖液和1 mL 1.0 mmol/L的ABTS溶液，反應(yīng)5 min后置于冰水浴中停止反應(yīng)，離心分離，測上清液在420 nm處的吸光度，每克載體每分鐘使1 μmol的ABTS氧化所需的酶量定義為一個酶活單位。

3 結(jié)果與討論

3.1 游離漆酶的最適pH值及pH穩(wěn)定性

圖1是不同pH值下游離漆酶催化ABTS反應(yīng)體系的吸光度變化隨時間的變化關(guān)系，由于酶活性與吸光度變化值成正比，所以吸光度變化越大，酶活越高。從圖1可以看到，反應(yīng)體系的吸光度值隨著反應(yīng)時間的進(jìn)行不斷增大，但不同pH值下吸光度的變化速度不同，當(dāng)pH值為3時，反應(yīng)體系的吸光度值變化最快，說明此時漆酶的活性最高，所以游離漆酶的最適pH值為3左右。

圖1 pH值對漆酶活性的影響

將游離漆酶在pH值為2～6的磷酸緩沖液中分別放置20 h后，測定酶的剩余活性，即可表示漆酶在不同pH值下的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看到，放置20 h后，與新鮮漆酶的活性相比，反應(yīng)體系4 min后的吸光度值，即漆酶活性均發(fā)生了一定的變化，不同的是，pH值越低，酶活下降越多，而pH值越高，酶活則比較穩(wěn)定，但總體上看pH值為3.5時漆酶表現(xiàn)出最高的吸光度值。

圖2 pH值對漆酶穩(wěn)定性的影響

3.2 給酶量對漆酶固定化的影響

用pH值為3.5的磷酸緩沖液配制不同濃度的漆酶溶液，分別在SBA-15上固定20 h，測得不同給酶量(漆酶與載體的質(zhì)量比)下固定化漆酶的活性，結(jié)果如圖3所示，固定化漆酶的活性隨著給酶量的增大先升高，當(dāng)給酶量為48 mg/g時，固定化漆酶的活性最高，繼續(xù)增大給酶量，固定化漆酶的活性反而有所降低，這可能是因為負(fù)載于SBA-15分子篩孔道內(nèi)的漆酶分子過多，影響了反應(yīng)過程中物質(zhì)的擴散與傳輸效率。

圖3 給酶量對固定化漆酶活性的影響

3.3 固定化漆酶的操作穩(wěn)定性

與游離漆酶相比，固定化漆酶可以重復(fù)利用，經(jīng)過反復(fù)8批次的反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看到，第1批次反應(yīng)后，固定化漆酶的活性有所下降，可能是一些與載體結(jié)合較弱的漆酶在反應(yīng)中被洗脫，第5批次反應(yīng)后，固定化漆酶的活性又有所下降，可能是操作過程中固體反復(fù)使用有所損失造成的。盡管如此，經(jīng)過8批次的反應(yīng)后，固定化漆酶的剩余活性仍然達(dá)到85%以上，表現(xiàn)出較好的操作穩(wěn)定性，具有一定的應(yīng)用價值。

圖4 固定化漆酶的操作穩(wěn)定性

4 結(jié)論

SBA-15介孔分子篩是一種具有大比表面積和豐富孔道結(jié)構(gòu)的無機材料，機械強度高，水熱穩(wěn)定性好，是進(jìn)行酶固定化的優(yōu)異載體。本研究結(jié)果表明，通過物理吸附法，漆酶可以固定于SBA-15的孔道內(nèi)，在pH值為3.5，給酶量為48 mg/g時，可以得到性能較佳的固定化漆酶。與游離漆酶相比，固定化漆酶經(jīng)過8批次的反應(yīng)后，剩余活性仍然達(dá)到85%以上，表現(xiàn)出良好的操作穩(wěn)定性，具有一定的應(yīng)用價值。