楊欣，李亞輝，沙宗閣，李堯鋒，楊長(zhǎng)福

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

乙型肝炎是危害人類(lèi)健康的多發(fā)病之一，由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起，我國(guó)是HBV感染高發(fā)區(qū)[1]。近年來(lái)，人們生活水平逐漸提高，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)發(fā)病率逐年升高[1-2]。目前，出現(xiàn)了慢性HBV感染合并NAFLD的患者，通常認(rèn)為乙型肝炎和NAFLD具有協(xié)同作用，可加重肝臟損傷[3]。所以預(yù)防乙型肝炎和NAFLD同時(shí)發(fā)生，防止因協(xié)同損傷作用誘發(fā)肝臟纖維化、肝硬化和肝癌等疾病的發(fā)生有重要意義。

黃連(CoptischinensisFranch.)藥用歷史悠久，有關(guān)該藥的研究主要集中在保肝、抗腫瘤和降壓等方面[4]。已經(jīng)有研究表明，黃連素、黃連復(fù)方、黃連水提取物等在肝損傷、肝硬化、肝癌中發(fā)揮重要作用[5]。由于中藥化學(xué)成分眾多，采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)篩選抗HBV和NAFLD的活性成分及靶點(diǎn)工作量較大。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)的出現(xiàn)，多學(xué)科的相互交叉，為中醫(yī)藥的發(fā)展增添了新思想和新技術(shù)，同時(shí)降低了實(shí)驗(yàn)工作量和成本[6]。國(guó)內(nèi)外對(duì)乙型肝炎和NAFLD之間的關(guān)聯(lián)性及影響研究筆者較少見(jiàn)到。筆者在本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接探討黃連防治乙型肝炎和NAFLD的分子機(jī)制，以期篩選最佳活性成分，為保肝藥物的開(kāi)發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1在線軟件與數(shù)據(jù)庫(kù) Cytoscape 3.5.1版軟件(http：//www.cytoscape.org)；DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.Drugbank.ca/)；可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)(Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery，DAVID，https：// david.ncifcrf.gov/)；基因比較數(shù)據(jù)庫(kù)(Commparative Toxicogenomics Database，http：//ctdbase.org/)；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmspsearch)；UniProt 數(shù) 據(jù) 庫(kù)(http：//www.uniprot.org/uniprot/)；SYBYL2.1軟件(Tripos)。所有軟件運(yùn)行于 Windows 操作系統(tǒng)平臺(tái)下(64位)，本項(xiàng)目使用的分析軟件均已獲授權(quán)或?yàn)殚_(kāi)源軟件。

1.2活性成分潛在靶點(diǎn)篩選 在線TCMSP[7]，輸入“黃連”，設(shè)置相關(guān)參數(shù)：參照口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、類(lèi)藥性(drug likeness，DL)、相對(duì)分子質(zhì)量(molecular weight，MW)、脂水分配系數(shù)(lipid-water partition coefficient，ALogP)篩選黃連活性成分。TCMSP人體靶標(biāo)數(shù)據(jù)來(lái)自 DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)[8]。借助間接靶點(diǎn)預(yù)測(cè)(SysDT) 模型篩選黃連潛在靶標(biāo)。采用隨機(jī)森林(random forests，RF) 和支持向量機(jī)(support vector machine，SVM)建立預(yù)測(cè)模型。黃連基于TCMSP在化學(xué)成分名稱中輸化學(xué)成分，統(tǒng)計(jì)靶標(biāo)蛋白數(shù)目?；虬袠?biāo)通過(guò)CTD查找。輸入黃連化學(xué)成分，顯示潛在靶標(biāo)基因名稱。統(tǒng)計(jì)潛在靶標(biāo)基因數(shù)目。將基因和蛋白名稱輸入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(kù)，查找Uniport ID，為通路分析做準(zhǔn)備。

1.3靶點(diǎn)通路分析 DAVID是基于WEB服務(wù)器的富集分析軟件，可對(duì)靶標(biāo)基因(蛋白)進(jìn)行功能分析、疾病分析、通路分析。本研究基于DAVID 中的京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway，KEGG)對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行通路富集分析，黃連活性成分84個(gè)靶點(diǎn)通過(guò)DAVID 6.8版在線進(jìn)行分析，其數(shù)據(jù)庫(kù)可以進(jìn)行靶點(diǎn)整合，將靶點(diǎn)整合到相同通路中進(jìn)行分析。結(jié)果得到靶標(biāo)蛋白參與的所有途徑，篩選出靶標(biāo)蛋白顯著參與的途徑(P≤0.01)，通過(guò)Rstudio中的ggplot2繪制前25條通路，包括通路名稱、Rich factor、富集分析的P值和Q值等。

1.4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction network，PPI)分析 PPI分析有助于從系統(tǒng)角度揭示疾病分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新藥靶點(diǎn)，篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。STRING數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)搜索已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以通過(guò)蛋白名稱(protein by name)、蛋白序列(protein by sequence)、多個(gè)蛋白名稱(multiple proteins)和多條蛋白序列(multiple sequences)進(jìn)行相互作用分析[8]。STRING用于字符串相關(guān)操作?；趯?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、PubMed文本數(shù)據(jù)挖掘的結(jié)果、其他數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)，采用基因融合、系統(tǒng)進(jìn)化譜、染色體臨近等生物信息學(xué)方法進(jìn)行預(yù)測(cè)，最后以綜合打分形式衡量結(jié)果。對(duì)24個(gè)乙型肝炎靶點(diǎn)和15個(gè)NAFLD靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析，將乙型肝炎和NAFLD通路中39個(gè)潛在靶標(biāo)輸入STRING，輸入潛在靶點(diǎn)名稱，選擇人源。每一個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白，節(jié)點(diǎn)右上方為基因名稱，每一條邊代表潛在靶點(diǎn)之間的功能性關(guān)聯(lián)?；陂_(kāi)源的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析與可視化平臺(tái)Cytoscape3.5.1版進(jìn)行繪制，根據(jù)度(degree)的大小篩選關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[9]。

1.5小分子的優(yōu)化處理 基于SYBYL對(duì)黃連小分子加氫、加電荷[10]，每個(gè)分子進(jìn)行最低能量?jī)?yōu)化及加氫處理，優(yōu)化次數(shù)為10 000，選擇Tripos 標(biāo)準(zhǔn)分子力場(chǎng)和添加 Gasteiger-Hückel 電荷，基于 Powell能量梯度法優(yōu)化得到最低能量構(gòu)象，進(jìn)行能量?jī)?yōu)化的目的是尋找配體分子的最低能量構(gòu)象以模仿自然體系中的分子穩(wěn)定構(gòu)象，保存為SLN格式。

1.6黃連活性成分與靶標(biāo)蛋白能量匹配 采用藥物分子設(shè)計(jì)模擬 SYBYL2.1 軟件的Surflex-Dock 模塊完成分子對(duì)接研究[11-12]。選擇具有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持的靶標(biāo)蛋白與黃連活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(protein databank，PDB，http：//www.rcsb.org/pdb )下載晶體結(jié)構(gòu)[13]，結(jié)合文獻(xiàn)優(yōu)先選擇復(fù)合了相應(yīng)生物活性配體且分辨率較高的晶體結(jié)構(gòu)[14-17]，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3 precursor，CASP3，PDBID：1RHQ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1，PDBID：3RJR)、白細(xì)胞介素- 6(IL-6，PDBID：1ALU)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopro teimase-9,MMP9，PDBID：966C)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP3，PDBID：1HY7)、促分裂素原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1，PDBID：2Y9Q)和促分裂素原活化蛋白激酶3(MAPK3，PDBID：4QTB)與黃連活性分子進(jìn)行能量匹配，這些晶體分別在3.00 ?，3.05 ?，1.90 ?，1.90?，1.40 ?，1.55 ?，1.50 ?的解象下以X衍射方法獲得。將小分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中的低能構(gòu)象與靶標(biāo)進(jìn)行柔性對(duì)接，對(duì)接過(guò)程中閾值參數(shù)0.5，膨脹系數(shù)1，其他參數(shù)為系統(tǒng)缺省值。選用 AMBER7 FF99 力場(chǎng)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化；另外選擇 Automatic 模式產(chǎn)生活性口袋，優(yōu)化完畢后保存為 SFXC 文件作為對(duì)接文件，其他所有參數(shù)均采用SYBYL2.1默認(rèn)值。利用Surflex-Dock分子對(duì)接模塊的 Total-Score 打分函數(shù)對(duì)小分子與靶標(biāo)相互作用進(jìn)行評(píng)分，Total-Score 函數(shù)綜合考慮了極性作用、疏水作用、焓和溶劑化等因素，該值越大，對(duì)接復(fù)合物越穩(wěn)定，說(shuō)明小分子化合物與大分子蛋白質(zhì)的匹配結(jié)合作用越好。以 Total-Score 等于 5為閾值，挑選對(duì)接效果好的化合物。

1.7相互作用分析 Ligplot作為經(jīng)典的配體與蛋白二維相互作用作圖軟件，應(yīng)用較廣泛，氫鍵和疏水作用基于HBPLUS程序計(jì)算，以2D形式展示結(jié)構(gòu)。本研究基于Ligplot1.4.5軟件，將黃連活性最高的化學(xué)成分穆坪馬兜鈴酰胺與RACα絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1)、MAPK3、MMP9、MMP3、TGF-β1、CASP3、MAPK1分別合并(Merg命令)為PDB格式(Program Data Base)保存，導(dǎo)入Ligplot軟件，并自動(dòng)計(jì)算形成的氫鍵、疏水作用和結(jié)構(gòu)比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1黃連活性成分篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中參照OB≥40%、DL≥0.18、-2≤ALogP≤5、MW≤500篩選黃連化學(xué)成分，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃連化學(xué)成分

Table.1ChemicalcomponentofCoptischinensisFranch

中文名稱英文名稱OB/%DLMWALogP廣玉蘭內(nèi)酯magnograndiolide63.710.19266.371.18穆坪馬兜鈴酰胺moupinamide86.710.26313.382.86鹽酸巴馬汀palmatine64.600.65352.443.65(R)-四氫小檗堿 (R)-canadine55.370.77339.423.40槲皮素quercetin46.430.28302.251.50甲基黃連堿worenine45.830.87334.373.73表小檗堿epiberberine43.090.78336.393.45黃柏酮obacunone43.290.77454.562.68

2.2黃連活性成分潛在靶標(biāo) 基于TCMSP、CTD及 Uniport查找黃連化學(xué)成分潛在靶標(biāo)，其中鹽酸巴馬汀潛在靶標(biāo)14個(gè)，(R)-四氫小檗堿潛在靶標(biāo)3個(gè)，槲皮素潛在靶標(biāo)63個(gè)，甲基黃連堿潛在靶標(biāo)7個(gè)，表小檗堿潛在靶標(biāo)10個(gè)，黃柏酮潛在靶標(biāo)14個(gè)，共111個(gè)潛在靶標(biāo)。除去相同的潛在靶標(biāo)，黃連化學(xué)成分共有潛在靶標(biāo)84個(gè)(圖1)。廣玉蘭內(nèi)酯和穆坪馬兜鈴酰胺無(wú)潛在靶標(biāo)，采用分子對(duì)接進(jìn)一步研究。

紅色節(jié)點(diǎn)：靶標(biāo)；藍(lán)色節(jié)點(diǎn)：化學(xué)成分。

Red node：target；blue node：chemical component.

Fig.1Interactionnetworkofcomponents-targets

2.3潛在靶標(biāo)通路分析 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov/)對(duì)靶標(biāo)蛋白進(jìn)行通路注釋，得到靶標(biāo)蛋白所參與的所有途徑，篩選出靶標(biāo)蛋白顯著參與的途徑(P≤0.01)，84個(gè)差異蛋白共篩選出代謝途徑83條，采用R語(yǔ)言的ggplot2輸出前25條通路。25條通路中包括乙型肝炎(P-Value=3.5E-19)和NAFLD(P-Value=9.9E-8)通路(圖2)。

2.4乙型肝炎、NAFLD通路共有靶標(biāo)分析 NAFLD通路包括潛在靶標(biāo)15個(gè)，乙型肝炎通路包括潛在靶標(biāo)24個(gè)。通過(guò)構(gòu)建通路-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)模型(圖3)，發(fā)現(xiàn)CASP3、CASP8、 TGF-β1、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-6、轉(zhuǎn)錄因子p65(transcription factor p65，RELA)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(transcription factor AP-1，JUN)、AKT1、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子BAX(apoptosis regulator，BAX)為乙型肝炎和NAFLD通路共有靶點(diǎn)。

圖2 潛在靶標(biāo)通路分析

Fig.2Pathwayanalysisonpotentialtarget

紅色節(jié)點(diǎn)：疾病名稱；藍(lán)色節(jié)點(diǎn)：靶標(biāo)蛋白；黃色節(jié)點(diǎn)：乙型肝炎和NAFLD共有靶標(biāo)蛋白。

圖3 通路-靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)模型

Red node：disease name;blue node：target protein;yellow nod：common target protein of HB and NAFLD.

Fig.3Networkmodelofpathway-target

2.5PPI分析 PPI分析結(jié)果顯示：整個(gè)網(wǎng)絡(luò)以MAPK1、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2(Apoptosis regulator Bcl-2)、IL-6、MAPK3、AKT1(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase)(degree>26)為中心節(jié)點(diǎn)緊密關(guān)聯(lián)。去掉中心節(jié)點(diǎn)，整個(gè)網(wǎng)絡(luò)渙散。進(jìn)一步明確代表NAFLD和乙型肝炎的靶標(biāo)相互關(guān)聯(lián)(圖4)。

2.6分子對(duì)接 Surflex-Dock 具有速度快、準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)，對(duì)接結(jié)果以Total Score、Crash和Polar 等參數(shù)值輸出。Surflex-Dock 打分函數(shù)是以-log10 為單位模擬結(jié)合能力，配體與受體結(jié)合穩(wěn)定性以Total Score>5為閾值進(jìn)行評(píng)價(jià)(表2)，黃連4個(gè)活性成分[穆坪馬兜鈴酰胺、鹽酸巴馬汀、槲皮素、 (R)-四氫小檗堿]能同時(shí)調(diào)節(jié)≥3個(gè)靶標(biāo)蛋白，化學(xué)成分結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5，通過(guò)分子對(duì)接進(jìn)一步明確其關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白為MAPK1、MAPK3、MMP3和CASP3。

綠色：乙型肝炎和NAFLD通路共有靶標(biāo)；紅色：乙型肝炎靶標(biāo)；藍(lán)色：NAFLD靶標(biāo)

圖4 靶標(biāo)蛋白相互作用

Green：common targets of HB and NAFLD；Red：Hepatitis B targets；blue：NAFLD targets.

Fig.4Interactionoftargetprotein

2.7相互作用分析 本研究基于Ligplot1.4.5版軟件自動(dòng)計(jì)算形成的氫鍵、疏水作用和結(jié)構(gòu)比對(duì)(圖6)?；瘜W(xué)成分穆坪馬兜鈴酰胺與7個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白形成16氫鍵，63個(gè)氨基酸位點(diǎn)?？梢酝茰y(cè)表3中這些氨基酸殘基可能要尋找AKT1、 CASP3、TGF-β1、MAPK1、MAPK3、MMP9和MMP3的重要?dú)埢?，它們?cè)跊Q定酶的催化特性中起到了重要作用。

3 討論

中藥具有活性成分多、調(diào)節(jié)靶點(diǎn)多和藥理作用多等特點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和計(jì)算虛擬平臺(tái)為化合物的篩選提供了較好的補(bǔ)充和替代手段。本研究基于整合平臺(tái)，研究了黃連保肝物質(zhì)基礎(chǔ)，明確黃連中穆坪馬兜鈴酰胺、鹽酸巴馬汀、槲皮素、 (R)-四氫小檗堿是治療NAFLD、乙型肝炎主要活性成分。已經(jīng)有研究表明[18-21]，槲皮素、小檗堿對(duì)急性肝損傷和NAFLD有保護(hù)作用。乙型肝炎患者肝臟解毒功能降低，肝臟合成、代謝、排泄等功能失常，甚至導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，使機(jī)體出現(xiàn)肝功能失代償體征。NAFLD主要特征為肝細(xì)胞大泡性脂肪變性綜合征，根據(jù)炎癥和纖維化級(jí)別分為單純性脂肪肝、肝硬化、NAFLD。NAFLD發(fā)病率逐年上升，與肥胖、血脂異常、糖尿病、代謝異常等諸多疾病關(guān)系密切。影響身心健康，預(yù)防和治療NAFLD、乙型肝炎成為臨床難題。目前，臨床主要采用降脂藥、調(diào)節(jié)胰島素、控制體質(zhì)量等方式治療上述疾病，往往不良反應(yīng)較大。筆者在本研究采用分子對(duì)接明確黃連活性成分，通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮治療NAFLD和乙型肝炎作用，明確MAPK1、MAPK3、MMP3和CASP3可能是黃連治療NAFLD和乙型肝炎關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中CASP3為NAFLD和乙型肝炎的共有靶點(diǎn)。CASP3在多種疾病中發(fā)揮重要作用，影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。研究表明，乙型肝炎患者CASP3高表達(dá)，CASP8和CASP9可以激活CASP3，CASP3主要執(zhí)行促細(xì)胞凋亡作用[22]；MAPK1和MAPK3在MAPK信號(hào)通路起著重要作用，已知肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展與MAPK信號(hào)通路最為密切[23]。黃連為經(jīng)典清熱解毒中藥，保肝效果值得進(jìn)一步研究，本研究可為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)靶點(diǎn)選擇、組分配伍提供理論參考。

表2 活性成分與靶標(biāo)蛋白分子對(duì)接

A.廣玉蘭內(nèi)酯；B.穆坪馬兜鈴酰胺；C.鹽酸巴馬汀；D.(R)-氫化小檗堿；E.槲皮素；F.甲基黃連堿；G.表小檗堿；H.黃柏酮。

圖5 黃連化學(xué)成分結(jié)構(gòu)式

A.magnograndiolide；B.moupinamide；C.palmatine；D.(R)-canadine；E.quercetin；F.worenine；G.epiberberine；H.obacunone.

Fig.5StructuralformulaofchemicalcompositioninCoptischinensisFranch

表3 穆坪馬兜鈴酰胺與靶標(biāo)蛋白形成的氫鍵及疏水作用

圖6 穆坪馬兜鈴酰胺與靶標(biāo)蛋白相互作用分析

Fig.6Analysisoftheinteractionbetweenmoupinamideandtargetprotein