文│張振 倪和民 郭勇 張永紅 邢凱（北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院）王楚端（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

microRNA（miRNA）是一類由大約22個(gè)核苷酸組成的小非編碼RNA，廣泛的參與了生物的各種生命活動(dòng)。高通量測(cè)序技術(shù)為miRNA的發(fā)現(xiàn)、挖掘miRNA生物學(xué)功能提供了新的技術(shù)手段和平臺(tái)。本文綜述了高通量測(cè)序技術(shù)挖掘豬在脂肪代謝、肌肉發(fā)育、繁殖生理、免疫應(yīng)答等方面功能miRNA的研究進(jìn)展，旨在為研究miRNA功能和豬品種的遺傳改良提供新的理論基礎(chǔ)和研究思路。

一、microRNA的簡(jiǎn)介和作用機(jī)制

microRNA（miRNA）是一類由大約2 2 個(gè)核苷酸組成的小非編碼RNA，它可以通過(guò)與目標(biāo)基因的3’UTR端的非編碼RNA結(jié)合抑制其翻譯或促進(jìn)其降解，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控生物過(guò)程的目的。miRNA在真核生物中廣泛的表達(dá)，是一類具有高度的保守性和內(nèi)源性的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。miRNA的表達(dá)具有位相性和時(shí)序性，在不同發(fā)育階段、組織中的表達(dá)差異顯著。目前為止，生物體內(nèi)已經(jīng)有超過(guò)2000個(gè)miRNA被證實(shí)。在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期、分化和增殖的過(guò)程中，超過(guò)60%基因的表達(dá)直接miRNA的調(diào)控。在豬上，miRNA已經(jīng)被證實(shí)參與了多個(gè)生理和病理上的調(diào)控。

miRNA調(diào)控靶基因表達(dá)的方式主要有兩種：靶基因mRNA的剪切降解和抑制靶基因的翻譯。沉默復(fù)合物（miRNA-induced silencing complex,miRISC）中的AGO（argonaute,AGO）蛋白引導(dǎo)miRNA識(shí)別靶基因，當(dāng)二者的序列完全配對(duì)時(shí)引起靶基因mRNA的剪切和降解。另一種情況是miRNA可以通過(guò)種子序列（一般為miRNA的第2～8nt）與靶基因mRNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)抑制其翻譯。成熟的miRNA不僅可以通過(guò)與靶基因mRNA的3’UTR結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用，也可與5’UTR及CDS區(qū)結(jié)合?？梢?，miRNA在生命過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用的途徑是多種且復(fù)雜的。

二、microRNA的生物合成過(guò)程

miRNA的生物合成過(guò)程基本上已經(jīng)被證實(shí)。根據(jù)miRNA在基因上的位置，miRNA可以分為存在于內(nèi)含子上的miRNAs和大多數(shù)的存在于無(wú)效編碼蛋白質(zhì)的基因間miRNAs。內(nèi)含子miRNAs與它的宿主基因一起被轉(zhuǎn)錄，而基因間miRNAs大多數(shù)情況下具有包括啟動(dòng)子和終止子的獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單元。miRNA基因可以通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，其中大部分基因間的miRNAs和所有的內(nèi)含子miRNAs是通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄?？赡芎袔浊€(gè)堿基的初級(jí)miRNA被蛋白復(fù)合酶 Drosha切割成具有70個(gè)核苷酸左右的莖環(huán)狀前體miRNA。細(xì)胞核內(nèi)的前體miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，然后被Dicer加工成成熟的原始雙鏈miRNAs。

成熟的雙鏈miRNAs與miRNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（miRNA-induced silencing complex, miRISC）結(jié)合后，其中一條鏈（miRNA）被降解。細(xì)胞核內(nèi)的前體miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，然后被Dicer加工成成熟的原始雙鏈miRNAs。成熟的雙鏈miRNAs與miRNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（miRNAinduced silencing complex, miRISC）結(jié)合后，其中一條鏈（miRNA）被降解。MiRNA和miRNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物一起轉(zhuǎn)運(yùn)到靶基因處，通過(guò)miRNA的種子序列與靶基因序列的結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。

三、研究microRNA的方法及高通量測(cè)序優(yōu)點(diǎn)

miRNA可以通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)和試驗(yàn)檢測(cè)的方法進(jìn)行研究。計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)miRNA的原理主要是基于miRNA的序列信息、二級(jí)結(jié)構(gòu)（發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)）、熱力學(xué)穩(wěn)定性和物種保守性等，主要軟件有MirScan、miRseeker、miRAlign、MiRRim、ProMiR、Mireval、MiRFinder、miPred、miRanalyzer等。鑒定miRNA的試驗(yàn)方法主要有克隆測(cè)序、Northern雜交技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、miRNA表達(dá)芯片技術(shù)和miRNA組測(cè)序技術(shù)等。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，miRNA組測(cè)序技術(shù)有著準(zhǔn)確度高、通量大、測(cè)序成本不斷下降、運(yùn)行時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于挖掘豬功能miRNA中。

四、高通量測(cè)序技術(shù)在挖掘豬功能microRNA的研究進(jìn)展

miRNA在豬肌肉、脂肪、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。另外，高通量測(cè)序技術(shù)在豬microRNA的挖掘和差異表達(dá)研究中發(fā)揮著較大的作用?；诟咄繙y(cè)序技術(shù)挖掘豬microRNA主要在脂肪代謝、肌肉發(fā)育、繁殖生理、免疫應(yīng)答等過(guò)程相關(guān)的組織中，為miRNA在這些過(guò)程中的作用提供理論基礎(chǔ)和研究思路。

1.脂肪代謝。Bai等利用SOLID平臺(tái)對(duì)閹割和未閹割公豬背膘組織miRNAs進(jìn)行了大規(guī)模的測(cè)序，共鑒定出177個(gè)差異表達(dá)microRNA，其靶基因主要富集在細(xì)胞增殖、凋亡、分化等過(guò)程中，為深入研究閹割對(duì)脂肪的影響奠定了良好的基礎(chǔ)。

Mentzel等采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了肥胖型、瘦肉型的公豬和母豬的脂肪組織的microRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)mir-124a、mir-9等在肥胖型豬上高表達(dá)，為揭示其功能提供了基礎(chǔ)。

Li等比較了長(zhǎng)白豬和藍(lán)塘豬的脂肪組織的microRNA組，檢測(cè)到25個(gè)microRNA在長(zhǎng)白豬中高表達(dá)和23個(gè)在藍(lán)塘豬中高表達(dá)，為揭示microRNA在脂肪沉積中的功能提供了基礎(chǔ)。

Ma等比較了肌間脂肪和皮下脂肪的microRNA組，檢測(cè)到在二者中差異表達(dá)的microRNA主要參與了免疫和炎癥反應(yīng)，為肥胖的研究提供了新的視角。

Gaffo等采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了伊比利亞白豬皮下脂肪的microRNA，共發(fā)現(xiàn)222個(gè)已知的microRNA，68個(gè)新的microRNA和17個(gè)miRNA-offset，其中表達(dá)最豐富的microRNA可能參與了Wnt信號(hào)通路和軸突通路，闡明了部分microRNA參與脂肪代謝的生物學(xué)功能。

Chen等比較了大白豬和梅山豬背膘組織的microRNA，檢測(cè)到8個(gè)差異表達(dá)的microRNA，其中miR-135和miR-183可能通過(guò)WNT信號(hào)通路影響豬背部皮下脂肪組織的發(fā)育。

Miao等檢測(cè)了金華豬和長(zhǎng)白豬的肌內(nèi)脂肪組織內(nèi)的miRNA，發(fā)現(xiàn)了大量參與脂肪酸代謝的miRNAs，為闡明miRNA調(diào)控肌內(nèi)脂肪提供了基礎(chǔ)信息。

Liu等比較了出生前70天胚胎和出生后70天仔豬肝臟的miRNA組，發(fā)現(xiàn)miR-122、miR-26a、miR-199a-5p和miR-30a-5p在脂類代謝的過(guò)程中起到了重要的作用。

Liu等比較了具有極端差異背膘厚度豬的脂肪組織miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-31-5p可能通過(guò)調(diào)控AQP9和GLIPR1基因的表達(dá)影響豬皮下脂肪的沉積。

Davoli等同樣比較了不同背膘厚度豬背膘中的miRNA，發(fā)現(xiàn)31個(gè)差異表達(dá)的miRNA，并構(gòu)建了潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

Sun等比較了顯著差異肌內(nèi)脂肪含量的大約克豬的肌肉組織的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-365-3p可能調(diào)控了肌內(nèi)脂肪生成的過(guò)程。

2.肌肉發(fā)育。C h e n 等利用Illumina 測(cè)序平臺(tái)對(duì)萊蕪豬和大約克豬的背最長(zhǎng)肌組織miRNAs進(jìn)行了高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了19個(gè)顯著差異表達(dá)的microRNA，其結(jié)果為肌肉在不同豬種之間的發(fā)育提供了研究基礎(chǔ)。

Z h a n g 等比較了注射脂多糖和生理鹽水豬的背最長(zhǎng)肌組織的microRNA組，鑒定得到9個(gè)差異表達(dá)的microRNA，為脂多糖在肌肉中發(fā)揮的作用奠定了理論基礎(chǔ)。

Mai等利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)豬5個(gè)發(fā)育時(shí)期的microRNA，共發(fā)現(xiàn)了404個(gè)已知的豬microRNA和118個(gè)新的microRNA，其中部分在基本肌肉功能中發(fā)揮重要作用，還有部分參與了肌肉的分化和形態(tài)發(fā)育的過(guò)程，這些發(fā)現(xiàn)為了解microRNA在肌肉中的全面功能提供了基礎(chǔ)。

Hou等采用Solexa測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了豬肌肉18個(gè)發(fā)育階段的microRNA，共發(fā)現(xiàn)197個(gè)已知的microRNA和78個(gè)新的microRNA，檢測(cè)到部分microRNA及其靶基因參與了生肌作用、BMP2、MAPK1信號(hào)通路等通路，為microRNA在肌肉發(fā)育中的作用提供了理論基礎(chǔ)。

Li等檢測(cè)了長(zhǎng)白豬和藍(lán)塘豬的肌肉組織的microRNA組，發(fā)現(xiàn)21個(gè)microRNA在藍(lán)塘豬肌肉組織中高表達(dá)和33個(gè)microRNA在長(zhǎng)白豬中高表達(dá)，為揭示microRNA在肌肉發(fā)育中的功能提供了基礎(chǔ)。

Liu等檢測(cè)了氧化型和糖酵解型的肌肉組織中的microRNA，發(fā)現(xiàn)了114個(gè)保守的microRNA和89個(gè)新的microRNA，其中顯著差異表達(dá)miR-133、miR-23可能參與了影響能量代謝的通路。

Q i n 等 采 用S o l e x a 測(cè) 序 的 方法檢測(cè)了豬骨骼肌1 0 個(gè)發(fā)育時(shí)期的microRNA，發(fā)現(xiàn)247個(gè)已知的microRNA和297個(gè)新的microRNA，其中15個(gè)最豐富表達(dá)的microRNA可能參與了肌纖維分化的過(guò)程。

Siengdee等檢測(cè)了母豬懷孕后63天、90天和仔豬出生后180天的肌肉組織的microRNA組，其中部分差異表達(dá)的microRNA參與了肌肉發(fā)育的過(guò)程，為肌肉發(fā)育的microRNA調(diào)控提供了基礎(chǔ)。

Sheng等比較了大白豬和民豬出生后60天、120天、150天、180天和210天的肌肉組織的miRNA組，發(fā)現(xiàn)了ssc-miR-204可能參與了成肌細(xì)胞的增殖過(guò)程。

Xi等比較了通城豬和大白豬肌肉組織的miRNAomes，發(fā)現(xiàn)miR-499-5p可能通過(guò)降解肌動(dòng)蛋白解聚因子（destrin/actin depolymerizing factor,DSTN）發(fā)揮調(diào)控肌纖維發(fā)育的過(guò)程。

Hou等采用了Solexa測(cè)序的方法檢測(cè)了長(zhǎng)白豬、通城豬和五指山豬的肌肉組織的miRNA，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)參與肌肉發(fā)育的miRNA。

Zhang等比較了長(zhǎng)白豬和五指山豬早期發(fā)育的四個(gè)時(shí)期（配種后18天、21天、28天和35天）的背最長(zhǎng)肌組織的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)多個(gè)參與調(diào)控豬肌肉早期發(fā)育的miRNA。

3.繁殖生理。Lian等比較了公豬未成熟（30天）和成熟（180天）的睪丸組織microRNA組，檢測(cè)到122個(gè)差異表達(dá)miRNA，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，其靶基因在生精作用中起著重要作用。

Bidarimath等基于高通量測(cè)序結(jié)果比較了母豬配種后20天和50天的子宮內(nèi)膜淋巴球、子宮內(nèi)膜和滋養(yǎng)層的microRNA組，檢測(cè)到部分microRNA參與了免疫細(xì)胞發(fā)育、血管生成等，為microRNA在懷孕中的作用提供了新的視角。

Gu等檢測(cè)了母豬產(chǎn)仔后整個(gè)時(shí)期（至28天）母乳中的microRNA，為microRNA在母豬調(diào)控仔豬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中提供了一定的研究基礎(chǔ)。

Peng等比較了哺乳期金華豬和約克夏豬的乳腺組織的microRNA組，檢測(cè)到多個(gè)差異表達(dá)的microRNA，其中部分microRNA參與了乳腺發(fā)育和產(chǎn)奶性能，為研究microRNA的在乳腺中的分子生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

Luo等檢測(cè)了三個(gè)重要的生精時(shí)期豬的睪丸組織的microRNA，發(fā)現(xiàn)大量microRNA并進(jìn)行了生物功能分析，為其在生精中的作用提供了基礎(chǔ)信息。

Huang等比較了高低產(chǎn)仔數(shù)的母豬的卵巢組織microRNA組，鑒定出37個(gè)差異表達(dá)microRNA，進(jìn)一步通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-224、miR-99a、let-7c、miR-181c、miR-214和miR-21可能影響母豬的產(chǎn)仔數(shù)。

4.免疫應(yīng)答。Ye等利用SOLID測(cè)序鑒定了不同大腸桿菌抗性的豬腸道組織microRNA組，鑒定出58個(gè)差異表達(dá)miRNA，共對(duì)應(yīng)2036個(gè)靶基因，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)11個(gè)影響仔豬腹瀉的靶標(biāo)microRNA。

Liu等通過(guò)高通量測(cè)序結(jié)果比較了感染豬巨細(xì)胞病毒感染前后豬巨噬細(xì)胞的microRNA組，檢測(cè)到239個(gè)已知的microRNA和355個(gè)新的microRNA，并發(fā)現(xiàn)130個(gè)顯著差異表達(dá)的microRNA，這些為microRNA的分子調(diào)控機(jī)制提供了新的視角。

Wu等檢測(cè)了感染大腸桿菌F18易感型和抵抗型豬的十二指腸的microRNA，檢測(cè)到了311個(gè)已知的microRNA，其中15個(gè)microRNA在易感組顯著高表達(dá)，9個(gè)microRNA顯著低表達(dá)，其中miR-218-3p可能通過(guò)靶向DLG5基因影響宿主對(duì)大腸桿菌的反應(yīng)。

Wang等檢測(cè)了PolyI∶C刺激前后的大蒲蓮豬和長(zhǎng)白豬外周血細(xì)胞的microRNA，分別檢測(cè)到20個(gè)和23個(gè)差異表達(dá)microRNA，揭示了部分microRNA調(diào)控宿主對(duì)RNA病毒的免疫反應(yīng)機(jī)制。

Podolska等比較了感染胸膜肺炎放線桿菌的豬腎臟組織的microRNA組，檢測(cè)到29個(gè)差異表達(dá)的microRNA，其中mirR-155、miR-664-5p、miR-451等可能在炎癥反應(yīng)中起到了重要作用。

Liu等檢測(cè)感染傳染性腸胃炎病毒前后的豬腎臟組織的microRNA組，鑒定到284個(gè)已知的microRNA，其中顯著差異表達(dá)的microRNA59個(gè)，其靶基因主要富集在細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程和免疫系統(tǒng)等通路，為進(jìn)一步研究病毒預(yù)防和治療奠定基礎(chǔ)。

Li等比較了大白豬和確山黑豬的脾臟miRNA組，發(fā)現(xiàn)了參與免疫應(yīng)答和疾病抗性的候選miRNA。

Zhen等比較了感染了豬藍(lán)耳病病毒的大白豬和通城豬肺巨噬細(xì)胞的非編碼RNA，發(fā)現(xiàn)miR-378、miR-199a-3p、miR-10a-5p等調(diào)控了抵抗豬藍(lán)耳病病毒的免疫應(yīng)答過(guò)程。

Zhang等比較了感染和非感染豬藍(lán)耳病病毒的豬子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的miRNA組，發(fā)現(xiàn)miR-339-5p參與了細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

5.其他。Zhang等比較了大白豬和藏豬的心肌組織的microRNA組，鑒定得到20個(gè)差異表達(dá)miRNAs，為研究microRNA在低氧適應(yīng)性上的作用奠定了理論基礎(chǔ)。

Li等比較了藏豬和大約克豬的肝臟組織的microRNA組，鑒定出51個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中6個(gè)參與了葡萄糖和脂質(zhì)的代謝，這些為揭示藏豬肝臟的分子作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

Sharbati等利用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了豬十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的microRNA，共發(fā)現(xiàn)了332個(gè)已知的microRNA和201個(gè)新的microRNA，為全面了解microRNA調(diào)控腸道功能提供了基礎(chǔ)。

Xie等采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了豬的16個(gè)不同組織的microRNA，共檢測(cè)到437個(gè)保守的microRNA及86個(gè)候選的microRNA，這些發(fā)現(xiàn)為全面挖掘microRNA的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

Liu等采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了胚胎期90天、出生后30天及7年的成年豬的肝臟組織的microRNA組，檢測(cè)到部分參與了肝臟發(fā)育的microRNA，并且為microRNA的調(diào)控作用提供了新的有價(jià)值信息。

Zhang等采用高通量測(cè)序和表達(dá)芯片技術(shù)檢測(cè)了60日齡、120日齡和180日齡豬的垂體和丘腦組織的microRNA，在不同時(shí)期分別發(fā)現(xiàn)37個(gè)和30個(gè)差異表達(dá)microRNA，為了解腦部功能提供了新的知識(shí)。

Tao等采用高通量測(cè)序技術(shù)比較了斷奶和不斷奶1天、4天和7天仔豬的小腸組織的microRNA，分別檢測(cè)到16、98和22個(gè)差異表達(dá)microRNA，通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些microRNA可能參與了小腸的新陳代謝、壓力應(yīng)激和免疫功能。

Li等檢測(cè)了出生前和出生后混合組織的microRNA組，找到大量特異性表達(dá)的microRNA，為研究豬microRNA提供了新的廣闊視角。

P a w l i n a 等檢測(cè)了豬肝臟組織的microRNA，共鑒定出206個(gè)microRNA，其中68個(gè)是新的候選microRNA，表達(dá)最豐富的micorRNA的靶基因主要富集在細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)激活和酶活性等通路，為進(jìn)一步研究肝臟microRNA提供了基礎(chǔ)。

Sun等比較了大白豬和藏豬胃組織的miRNA，差異表達(dá)miRNAs，miR-214-3p和ssc-un39可能導(dǎo)致了二者消化能力不同的結(jié)果。

Huang等比較了金華豬和長(zhǎng)白豬肝臟組織的miRNA組，共發(fā)現(xiàn)35個(gè)差異表達(dá)的miRNA，這些miRNA可能參與了調(diào)控豬生長(zhǎng)和代謝的過(guò)程。

Chen等分析了貴州小型豬3個(gè)生長(zhǎng)階段（0天、30天和240天）9個(gè)組織（脂肪、肌肉、心臟、肝臟、腎臟、肺、脾、卵巢和睪丸）的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miRNA全面參與了豬生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程。

五、展望

綜上所述，可以看出miRNA廣泛參與了豬不同生長(zhǎng)階段的生長(zhǎng)發(fā)育、脂肪代謝、肌肉生長(zhǎng)、繁殖生理、免疫應(yīng)答等各個(gè)生理過(guò)程。高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為鑒定miRNA表達(dá)豐度和新miRNA的重要技術(shù)手段。同時(shí)，結(jié)合其他組學(xué)的測(cè)序結(jié)果，高通量測(cè)序技術(shù)也為鑒定miRNA的靶基因和生物學(xué)功能提供了新的思路。但是，大部分研究只是預(yù)測(cè)了miRNA的功能，其分子調(diào)控和遺傳機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。miRNA所調(diào)控的信號(hào)通路和基因表達(dá)的分子機(jī)制，將是在此基礎(chǔ)上未來(lái)研究的重點(diǎn)。