萬謙，何鑫，許小玲，薄廣旭，閆云君，

(1.華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學(xué) 中歐清潔與可再生能源學(xué)院，湖北 武漢 430074)

蓖麻油作為一類非食用油，具有分子結(jié)構(gòu)特殊[1]及脂肪酸組成單一(蓖麻油酸甘油酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)在80%以上[2])的優(yōu)勢。以蓖麻油為原料制備環(huán)氧蓖麻油不僅可用于制備植物油基多元醇替代石油聚醚多元醇生產(chǎn)聚氨酯[3]，還可作為原料用于制備涂料[4]、增塑劑[5]、油墨[6]及潤滑油[7]等，其特殊的組成及結(jié)構(gòu)使其擁有比環(huán)氧大豆油或環(huán)氧菜籽油更大的應(yīng)用前景[8]。當(dāng)前，蓖麻油已在我國實現(xiàn)了規(guī)模化種植[9]，其產(chǎn)量也在逐年攀升，有望在未來成為主流生物質(zhì)化工原料[10-11]。

化學(xué)法制備環(huán)氧植物油存在產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率低[12-13]、副反應(yīng)多、腐蝕性強(qiáng)[14]及污染嚴(yán)重[15-16]等缺點。而生物酶法不僅反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)選擇特異性好、轉(zhuǎn)化率高，且生產(chǎn)工藝簡單，后處理容易[17-18]。本文以蓖麻油為研究對象，在甲苯體系中以Novozyme435為催化劑，以生物酶法制備了環(huán)氧蓖麻油，并確定了最優(yōu)制備條件。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

脂肪酶Novozyme 435(10 000 U/g，酶活)，購自北京高瑞森科技有限公司；蓖麻油(82～90 g I2/100 g，碘值)購自廣州市東辰化工有限公司；蓖麻油酸(純度≥98%)由河北省阜城縣環(huán)宇油脂有限公司提供；雙氧水(30%，ω/ω)、甲苯、碘化鉀、淀粉、硫代硫酸鈉、一氯化碘、冰乙酸、環(huán)己烷、KOH、NaOH、鄰苯二甲酸氫鉀、鹽酸、丙酮、NaHCO3等均為分析純。

THZ-82水浴恒溫振蕩器；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；7890A/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀；Bruker Vertex70 FTIR型光譜儀；Bruker Ascend TM 600 MHZ型核磁共振波譜儀等。

1.2 原料性質(zhì)分析

將蓖麻油進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)分析，色譜圖見圖1，蓖麻油主要組分及含量見表1。

表1 蓖麻油的主要組分及含量

由表1可知，原料油中的主要成分為蓖麻油酸甘油三酯，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)86.16%。其他成分如棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸以及二十碳烯酸含量均較少?？偟牟伙柡椭舅岷坷塾嬤_(dá)93.39%，說明原料油不飽和程度高，環(huán)氧轉(zhuǎn)化空間大。依據(jù)GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》，測定蓖麻油的酸值為13.8 mgKOH/g；依據(jù)GB/T 5532—2008《動植物油脂碘值的測定》，測得的蓖麻油碘值為88.86 g/100 g。

1.3 實驗方法

1.3.1 蓖麻油環(huán)氧化過程 蓖麻油在脂肪酶Novozyme435的催化作用下，與過氧化氫發(fā)生過氧化反應(yīng)生成環(huán)氧蓖麻油，具體實驗步驟如下。

取250 mL具塞錐形瓶，按順序依次向其中加入10 g蓖麻油、一定量的蓖麻油酸、30%濃度的雙氧水、有機(jī)溶劑、催化劑Novozyme435，然后將250 mL錐形瓶放入轉(zhuǎn)速為225 r/min的水浴恒溫振蕩器中反應(yīng)。反應(yīng)后產(chǎn)物用100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%的碳酸氫鈉堿洗，接著用蒸餾水洗至中性，收集上層油液，減壓旋蒸得到淡黃色油狀液體即為環(huán)氧蓖麻油。其反應(yīng)機(jī)理見圖2。

圖2 Novozyme435催化蓖麻油環(huán)氧的反應(yīng)過程

1.3.2 環(huán)氧蓖麻油酸值與環(huán)氧值測定 依據(jù)GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》測定蓖麻油的酸值，依據(jù)GB/T 1677—2008《增塑劑環(huán)氧值的測定》測定環(huán)氧蓖麻油的環(huán)氧值，實際環(huán)氧值計算依據(jù)公式(1)，理論最大環(huán)氧值計算則為公式(2)。

實際環(huán)氧值X1(mol/100 g)可以通過式(1)計算(各字母含義參考國標(biāo)GB/T 1677—2008)。

(1)

理論最大環(huán)氧值X(mol/100 g)可以通過式(2)計算。

(2)

其中，IV0為實際測得的蓖麻油原料碘值(88.86 g/100 g)，Ai為I原子的摩爾質(zhì)量(126.9 g/mol)，A0為O原子的摩爾質(zhì)量(16.0 g/mol)；環(huán)氧轉(zhuǎn)化率為X1/X(%)。

1.3.3 蓖麻油和環(huán)氧蓖麻油的紅外(FTIR)表征 采用紅外光譜儀對蓖麻油(CO)和環(huán)氧蓖麻油(ECO)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，波長記錄范圍在4 000～400 cm-1之間。

1.3.4 蓖麻油和環(huán)氧蓖麻油的核磁氫譜(1H NMR)表征 采用核磁共振波譜儀對蓖麻油(CO)和環(huán)氧蓖麻油(ECO)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素條件優(yōu)化

2.1.1 反應(yīng)溫度對環(huán)氧蓖麻油環(huán)氧值的影響 取10 g蓖麻油，控制過氧化氫與蓖麻油雙鍵摩爾比為2∶1，反應(yīng)時間為24 h，Novozyme435催化劑添加量為4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))、搖床轉(zhuǎn)速為225 r/min、蓖麻油酸添加量為8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))以及甲苯添加量為110%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，研究反應(yīng)溫度對所得產(chǎn)物的環(huán)氧值的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對環(huán)氧蓖麻油環(huán)氧值的影響

反應(yīng)溫度是影響反應(yīng)速率的重要因素。一般來說，溫度越高，分子運(yùn)動越劇烈，反應(yīng)物發(fā)生碰撞的幾率越高，意味著酶與反應(yīng)底物接觸的頻率越高，反應(yīng)速率越快。但酶是一種具有生物活性的催化劑，其對溫度耐受性是有限的，一旦溫度超過閾值，酶就會失活，從而失去催化活性，所以只有選擇合適溫度，才能獲得最大的酶促反應(yīng)速率。由圖3可知，當(dāng)溫度為40 ℃時，得到的環(huán)氧蓖麻油具有最大的環(huán)氧值。當(dāng)溫度低于40 ℃時，分子運(yùn)動不夠劇烈，底物與酶碰撞頻率較低，不利于反應(yīng)速率的提高；當(dāng)溫度高于40 ℃時，溫度過高，酶的活性受到抑制，即使底物與酶的碰撞頻率提高，活性顯著降低的酶也無法有效提高反應(yīng)速率。因此，固定化脂肪酶Novozyme435催化雙氧水與蓖麻油反應(yīng)制備環(huán)氧蓖麻油的最適反應(yīng)溫度確定為40 ℃。

2.1.2 反應(yīng)時間對ECO環(huán)氧值的影響 按照上述反應(yīng)條件，研究反應(yīng)時間對所得產(chǎn)物環(huán)氧值的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，當(dāng)反應(yīng)時間為18 h時，得到的環(huán)氧蓖麻油具有最大環(huán)氧值。當(dāng)反應(yīng)時間為3～6 h時，環(huán)氧值升高最快，此時反應(yīng)速率最大，原因在于此時反應(yīng)底物的濃度是最高的。當(dāng)反應(yīng)時間為6～18 h時，產(chǎn)物環(huán)氧值的升高幅度開始減緩，反應(yīng)速率逐漸下降，原因是隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)底物的濃度開始逐步降低。當(dāng)反應(yīng)時間超過18 h，得到的環(huán)氧蓖麻油的環(huán)氧值呈現(xiàn)下降的趨勢。其原因為：反應(yīng)時間的延長會導(dǎo)致Novozyme435催化環(huán)氧基團(tuán)開環(huán)聚合的反應(yīng)不斷加深，致使最終產(chǎn)物環(huán)氧值的降低。在實際操作中發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移已合成的環(huán)氧蓖麻油會逐漸產(chǎn)生白色沉淀，在把旋蒸后的成品放置在60 ℃烘箱中過夜之后，這種情況就消失了(滅活殘留的酶)。因此，最適反應(yīng)時間確定為18 h。

圖4 反應(yīng)時間對環(huán)氧蓖麻油環(huán)氧值的影響

2.1.3 過氧化氫與蓖麻油雙鍵的摩爾比對ECO環(huán)氧值的影響 按照上述反應(yīng)條件，研究過氧化氫與蓖麻油雙鍵的摩爾比對所得產(chǎn)物環(huán)氧值的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 過氧化氫與蓖麻油雙鍵的摩爾比對環(huán)氧蓖麻油環(huán)氧值的影響

由圖5可知，當(dāng)過氧化氫與蓖麻油中雙鍵的摩爾比為2∶1時，得到的環(huán)氧蓖麻油具有最大環(huán)氧值。當(dāng)過氧化氫與蓖麻油中雙鍵的摩爾比低于2∶1時，反應(yīng)底物雙氧水的濃度較低，酶與底物的有效碰撞頻率也較低，反應(yīng)速率較慢；當(dāng)過氧化氫與蓖麻油中雙鍵的摩爾比高于2∶1時，過氧化氫濃度過大，對脂肪酶的毒害作用加劇，導(dǎo)致酶活性降低，反應(yīng)速率亦降低。只有取二者的平衡點過氧化氫與環(huán)氧蓖麻油中雙鍵摩爾比為2∶1時，才能獲得最佳效果。

2.1.4 蓖麻油酸添加量對ECO環(huán)氧值的影響 按照上述反應(yīng)條件，研究蓖麻油酸添加量對所得產(chǎn)物環(huán)氧值的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 蓖麻油酸添加量對環(huán)氧蓖麻油環(huán)氧值的影響

2.1.5 甲苯添加量對ECO環(huán)氧值的影響 按照上述反應(yīng)條件，研究甲苯添加量對所得產(chǎn)物環(huán)氧值的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 甲苯添加量對環(huán)氧蓖麻油環(huán)氧值的影響

由圖7可知，當(dāng)甲苯添加量為40%時，得到的環(huán)氧蓖麻油具有最大環(huán)氧值。甲苯作為反應(yīng)體系的有機(jī)溶劑，一方面可以有效降低反應(yīng)體系的粘度，使催化劑免于被裹附的困境；另一方面可以增加過氧化氫在反應(yīng)體系中的濃度(過氧化氫在非極性溶劑中的溶解度大于其在水中的溶解度[17]，而水的極性大于甲苯的極性)。當(dāng)甲苯添加量低于40%時，反應(yīng)體系的粘度過大，過氧化氫濃度不高，導(dǎo)致反應(yīng)速率低，產(chǎn)物的環(huán)氧值也不高。當(dāng)甲苯添加量高于40%時，甲苯溶劑添加量過大，稀釋了過氧化氫的濃度，導(dǎo)致反應(yīng)速率降低，產(chǎn)物的環(huán)氧值下降。綜上，甲苯添加量為40%時，才能獲得最佳效果。

2.1.6 催化劑添加量對ECO環(huán)氧值的影響 按照上述反應(yīng)條件，研究催化劑Novozyme435添加量對所得產(chǎn)物環(huán)氧值的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 催化劑添加量對環(huán)氧蓖麻油環(huán)氧值的影響

由圖8可知，隨著催化劑Novozyme435添加量的逐漸提高，得到的環(huán)氧蓖麻油環(huán)氧值逐漸趨平。當(dāng)催化劑添加量過少，其濃度較低，酶促反應(yīng)速率也較低，最終導(dǎo)致產(chǎn)物環(huán)氧值不高。當(dāng)催化劑添加量逐步升高時，最終產(chǎn)物的環(huán)氧值緩慢提高直至趨于平緩，但并未出現(xiàn)峰值。出于經(jīng)濟(jì)效益考慮，最終選取催化劑Novozyme435添加量為4%。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果與分析 在單因素條件優(yōu)化基礎(chǔ)上，確定影響環(huán)氧蓖麻油環(huán)氧值的3個主要因素分別為甲苯添加量、催化劑添加量、反應(yīng)溫度。根據(jù)Box-Behnken模型設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化方案，設(shè)計方案見表2。

根據(jù)3因素3水平的設(shè)計方案，SAS 9.2自動生成15組實驗。以產(chǎn)物環(huán)氧值作為響應(yīng)值，分析處理結(jié)果見表3。對數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，擬合得到3種因素對產(chǎn)物環(huán)氧值影響的二次回歸方程式：

Y1=-7.208 19+0.409 623X1+0.385 74X2+0.132 09X3-0.005 327X12+0.010 005X1X2-0.000 246X1X3-0.089 939X22+0.001 979X2X3- 0.001 523X32

(3)

為對二次回歸方程的擬合效果進(jìn)行進(jìn)一步檢驗，需對回歸方程進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表4。一般用顯著性水平α來檢驗系統(tǒng)的隨機(jī)誤差，當(dāng)Pr>F的概率<0.05時，則認(rèn)為模型顯著。表4中回歸模型(Model)的Pr>F的值<0.000 1，說明回歸模型為極顯著模型。失擬項的Pr>F的值為0.135 1，說明失擬檢驗不顯著，模型誤差較小。因此，二次回歸方程可以有效模擬不同條件下環(huán)氧蓖麻油的環(huán)氧值，擬合度良好。

另外，回歸方程的多重相關(guān)系數(shù)R2=99.24%，說明該反應(yīng)條件下合成的環(huán)氧蓖麻油的實際環(huán)氧值與通過回歸方程算得的值十分接近。同時，X2的一次項和二次項的Pr>F的值均<0.000 1，這說明催化劑Novozyme435的添加量對產(chǎn)物的環(huán)氧值影響是極顯著的。

表4 回歸方程方差分析

2.2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果的驗證 圖9展示了3因素3水平經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后得到的平面等高線圖和立體響應(yīng)面圖。

a.X2X3響應(yīng)面圖 b.X1X3響應(yīng)面圖 c.X1X2響應(yīng)面圖

d.X2X3等高線圖 e.X1X3等高線圖 f.X1X2等高線圖

由圖9可知，此模型存在頂點，軟件分析處理后給出頂點對應(yīng)參數(shù)，即為反應(yīng)的最優(yōu)條件：甲苯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.19%，催化劑Novozyme435質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.96%，反應(yīng)溫度為42.1 ℃，在此條件下模型預(yù)測的函數(shù)值Y1為5.23%(即環(huán)氧值)。

為驗證回歸模型的可靠性，須在最優(yōu)反應(yīng)條件下(甲苯用量43.19%、催化劑用量4.96%、反應(yīng)溫度42.1 ℃)合成環(huán)氧蓖麻油(設(shè)置2組平行)，并將最后得到的環(huán)氧蓖麻油環(huán)氧值與模型預(yù)測值比較。最后得到環(huán)氧蓖麻油的環(huán)氧值Y1為(5.20±0.19)%[根據(jù)公式(1)計算得環(huán)氧轉(zhuǎn)化率為97.93%]，與預(yù)測值5.23%極為接近，表明回歸模型可靠。

2.3 紅外(FTIR)表征

為進(jìn)一步確定環(huán)氧蓖麻油的生成，對蓖麻油(CO)和環(huán)氧蓖麻油(ECO)進(jìn)行紅外表征，其紅外圖譜見圖10。

圖10 蓖麻油與環(huán)氧蓖麻油的紅外圖譜

2.4 核磁氫譜(1H NMR)表征

為進(jìn)一步確定環(huán)氧蓖麻油的生成，對蓖麻油(CO)和環(huán)氧蓖麻油(ECO)也進(jìn)行了核磁表征，其核磁氫譜見圖11。

圖11 蓖麻油和環(huán)氧蓖麻油核磁共振氫譜

3 結(jié)論

與化學(xué)法相比，以脂肪酶Novozyme435為催化劑的生物酶法在植物油的環(huán)氧化上具有更高的選擇特異性，產(chǎn)物的環(huán)氧轉(zhuǎn)化率更高，副產(chǎn)物更少。同時，研究發(fā)現(xiàn)在生物酶法催化蓖麻油的環(huán)氧化過程中，游離脂肪酸是不可或缺的，其擁有載氧劑功能。催化劑Novozyme435的添加量對產(chǎn)物環(huán)氧值的影響是極顯著的，得到的反應(yīng)最優(yōu)條件為：甲苯用量43.19%，催化劑Novozyme435用量4.96%，反應(yīng)溫度42.1 ℃，過氧化氫與蓖麻油雙鍵摩爾比2∶1，蓖麻油酸用量8%及反應(yīng)時間18 h，環(huán)氧蓖麻油最大環(huán)氧值達(dá)5.20%，環(huán)氧轉(zhuǎn)化率達(dá)97.93%。