李 靜，付曉瑞，孫振昌，張明智

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

自然殺傷細胞/T細胞淋巴瘤(natural killer/T cell lymphoma, NKTCL)是一種高度侵襲性淋巴瘤，約占非霍奇金淋巴瘤的5%～18%[1-3]，以結外病變?yōu)橹?，好侵及鼻或面中線部，并伴有組織壞死和血管侵襲，為進行性、破壞性病變[4]。腫瘤細胞具有細胞毒性，表達CD56、CD2、CD3ε和CD30等。流行病學調查示，NKTCL的發(fā)病具有明顯的地域分布，亞洲及拉丁美洲較歐、美國家明顯多發(fā)，中位發(fā)病年齡為44～55歲，其發(fā)病機制尚不明確，可能與EB病毒感染具有高度相關性。對于NKTCL，國際上尚未出現(xiàn)統(tǒng)一標準的化療方案，其化療敏感性低，預后差，生存期短，早期治療常以單獨放療或聯(lián)合化療為主，進展期以化療為主，部分患者可獲短暫緩解卻極易復發(fā)，造血干細胞移植并不能改善NKTCL患者預后。

局限期(Ann Arbor分期Ⅰ、Ⅱ期)NKTCL對放療較為敏感，但緩解期短，約一半患者短期內(nèi)復發(fā)，縱然接受放化療聯(lián)合治療，5 a生存率也只有約50%；而對于晚期或進展期(Ann Arbor分期Ⅲ、Ⅳ期)患者，常規(guī)予以蒽環(huán)類藥物為基礎的治療方案，但療效不佳，腫瘤細胞高表達P-糖蛋白導致其對蒽環(huán)類藥物耐藥[5]。無論是美國NCCN指南還是歐洲ESMO指南均推薦以門冬酰胺酶為基礎的方案，其顯著改善了臨床療效。即便如此，每年仍有相當一部分患者出現(xiàn)耐藥或復發(fā)，5 a生存率低于30%。對此類人群迫切需要新的治療方法[6-8]。

血液惡性腫瘤具有高侵襲性和預后不良等特征，長期以來治療效果并不令人滿意[9-10]，隨著對疾病認識的深入，越來越多靶向藥物和免疫治療手段的應用為這些疾病的治療帶來一線曙光，尤其是嵌合抗原受體T(CAR-T)細胞治療近年來取得了令人矚目的效果。然而單克隆抗體藥物和CAR-T細胞治療取得非凡的臨床療效的同時，也增加了對藥物安全性評估的要求。本研究利用標準免疫組化技術檢測CD38與非靶器官的結合，可為臨床藥物監(jiān)測毒性提供參考。此外，檢測NKTCL中CD38的表達探討其作為免疫治療靶標的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料來源本研究收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科存檔的209例標本，包括169例不同部位正常組織、20例NKTCL組織、20例淋巴結增生組織。所有組織均經(jīng)40 g/L甲醛固定并包埋在石蠟中。

1.2 標準免疫組化技術檢測CD38方法所有切片均為連續(xù)切片，經(jīng)梯度乙醇脫蠟、水化，根據(jù)說明書使用S-P試劑盒(北京天根生化科技有限公司)進行了免疫組化染色，檢測CD38蛋白在不同組織中的表達和定位。結果由2位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生進行評估。對陽性細胞的百分比評分如下：0分為陰性表達，陽性細胞數(shù)<5%；1分為弱陽性，陽性細胞數(shù)5%～<25%；2分為中度陽性，陽性細胞數(shù)25%～<50%；3分為強陽性，陽性細胞數(shù)≥50%。

1.3 流式細胞術檢測CD38方法使用含體積分數(shù)10%胎牛血清和青霉素(1 000 u/mL)/鏈霉素(10 μg/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gbico公司)培養(yǎng)NKTCL細胞系。以1 000 r/min速度離心細胞5 min，加入100 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)，然后在4 ℃下用CD38抗體(美國BD公司)或同型對照抗體對表面染色15 min；之后用PBS洗3遍樣品并用FACS緩沖液重懸于流式管中，然后使用FACS Canto流式細胞儀(美國BD公司)進行上機收集數(shù)據(jù)。使用FlowJo V10(美國FlowJo公司)進行數(shù)據(jù)分析。NKTCL細胞系中CD38表達評分標準為：陽性細胞數(shù)超過陰性對照百分比≥80%為陽性，10%～<80%為部分表達，<10%為陰性。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析，CD38在NKTCL組織和增生淋巴結組織中的表達比較用秩和檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 CD38在不同組織中的表達169例不同解剖部位的正常組織中，CD38在脾、精囊腺、扁桃體、輸卵管和乳腺組織中呈現(xiàn)廣泛的強陽性表達，在前列腺、肺、膀胱、腎和直腸組織中顯示不同程度的陽性表達，其余組織中CD38陰性表達。在人類蛋白質譜數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)中搜索發(fā)現(xiàn)，CD38僅在前列腺、精囊腺、淋巴結和扁桃體中強陽性表達，而在闌尾、脾和骨髓中弱陽性表達。這與我們結果中CD38在脾、精囊腺和扁桃體中的強陽性表達基本相吻合。輸卵管和乳腺作為女性生殖系統(tǒng)也呈強陽性表達，表明CD38可能在生殖系統(tǒng)中高表達。肺、膀胱、腎和直腸的陽性表達可能是由于炎癥細胞浸潤引起CD38的高表達，該結果也可能與人種差異有關?？傊覀儗D38表達的免疫組化研究結果與數(shù)據(jù)庫研究結果高度吻合。見表1、圖1。

表1 不同組織中CD38蛋白表達

2.2 CD38在NKTCL和增生淋巴結組織中的表達NKTCL組織(強陽性8例，中度陽性6例，弱陽性2例，陰性4例)中CD38表達高于增生淋巴結組織(強陽性0例，中度陽性10例，弱陽性2例，陰性8例)，差異有統(tǒng)計學意義(Z=2.394，P=0.017)。NKTCL細胞系中CD38也顯示高表達，其中NKL和YT細胞系中陽性表達，NKYS細胞系中部分表達，而KHYG-1細胞系中陰性表達。提示CD38可能是NKTCL的免疫治療靶標。見圖1、2。

圖1 不同組織中CD38的表達

3 討論

CD38是Ⅱ型跨膜糖蛋白，具有酶活性，可催化環(huán)腺苷二磷酸核糖的合成與降解，在細胞鈣離子平衡調控中起重要作用。此外，CD38與配體CD31相互作用，在調節(jié)細胞遷移、受體介導的黏附以及信號傳導中也扮演著重要角色。在許多造血系統(tǒng)的惡性腫瘤(如非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤[11]、Waldenstr?m巨球蛋白血癥[12]、急性粒細胞白血病[13]和慢性淋巴細胞白血病)中，CD38的表達均有上調。此外，CD38還可以在幾種造血細胞中表達，包括自NK細胞、單核細胞以及部分T細胞和B細胞[14]。在某些免疫抑制細胞(如髓源性抑制細胞、調節(jié)性T細胞、調節(jié)性B細胞和某些NK細胞亞型)中也出現(xiàn)CD38蛋白表達。CD38-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸信號通路可以促進這些免疫抑制細胞的活性，并與抑制性腫瘤微環(huán)境的形成有關，間接促進腫瘤的免疫逃逸[15-19]。

CD38的表達使其成為治療性抗體藥物的開發(fā)靶點。目前，現(xiàn)已有daratumumab和isatuximab等2種CD38單抗獲批上市，適應證均為多發(fā)性骨髓瘤。CD38單抗主要通過補體依賴性細胞毒性反應和抗體依賴性細胞毒性反應等抗體Fc片段介導的免疫機制殺傷腫瘤細胞，并可誘發(fā)抗體依賴性吞噬和腫瘤細胞凋亡。此外，CD38抗體還可以拮抗調節(jié)性T細胞和調節(jié)性B細胞介導的免疫抑制，從而整體激活機體的免疫反應。

CD38在NKTCL組織中的高表達使得其可能作為治療靶點被作用。本文結果也證實，NKTCL組織中CD38表達高于增生淋巴結組織。一項回顧性研究[20]表明，在94例NKTCL患者中，只有5%的患者CD38陰性表達，超過50%的患者強陽性表達，且CD38的高表達與預后不良相關。而daratumumab單藥治療復發(fā)、難治性NKTCL的臨床試驗研究(NCT02927925)結果顯示，在32例患者中50%的患者CD38表達≥50%，客觀緩解率為25.0%，中位隨訪時間為16.7個月，一些患者實現(xiàn)了腫瘤縮小和EB病毒負荷降低，但沒有患者達到完全緩解。在血液學毒性中，最常見的是血小板減少、貧血、白細胞減少和中性粒細胞減少[21]?；A研究同樣發(fā)現(xiàn)，daratumumab能有效裂解高表達CD38的NKTCL，此外還發(fā)現(xiàn)L-天冬酰胺酶與daratumumab聯(lián)合使用對CD38高表達NKTCL細胞具有協(xié)同的細胞毒性作用[22]?？傮w而言，作為NKTCL的新治療靶標，CD38單抗仍處于探索性研究階段，與其他藥物聯(lián)合治療可能帶來更好的療效。

腫瘤組織高表達、正常組織低表達也使CD38可能成為CAR-T細胞治療的靶標。Mihara等[23]通過體外和體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，CD38 CAR-T細胞可以有效裂解耐藥的非霍奇金淋巴瘤細胞。他們隨后證實，CD38 CAR-T細胞可以靶向具有多重耐藥性的多發(fā)性骨髓瘤患者的腫瘤細胞和多發(fā)性骨髓瘤細胞系，并且在動物模型中觀察到同樣的現(xiàn)象[24]。CD38 CAR-T細胞治療復發(fā)、難治性多發(fā)性骨髓瘤的臨床試驗也在開展，但CAR-T細胞重要的不良反應之一脫靶效應值得人們重視。因此在CD38 CAR-T細胞的設計中，研究人員應考慮雙靶聯(lián)合或使用可控開關以避免對非靶標器官的損傷。在臨床應用中，還應考慮檢測非靶器官的特異指標，以便早期發(fā)現(xiàn)損傷。

盡管daratumumab在復發(fā)、難治性多發(fā)性骨髓瘤中顯示出較好的療效，但仍存在一些不容忽視的不良反應。無論是daratumumab單藥治療還是聯(lián)合治療多發(fā)性骨髓瘤的臨床試驗中，最常見的不良事件是與輸液相關的反應。此外，超過Ⅲ度的嚴重不良反應包括貧血、中性粒細胞減少、血小板減少、肺炎、上呼吸道感染和高血壓[25-28]。在臨床試驗GEN501、CASTOR 和POLLUX研究中觀察到肺炎的發(fā)生率分別為7%、8%和8%，可能與本研究發(fā)現(xiàn)的肺組織存在CD38陽性表達密切相關。這提示臨床醫(yī)生使用CD38單抗治療血液系統(tǒng)腫瘤時，應關注CD38高表達組織可能產(chǎn)生的損傷反應。

綜上所述，CD38在各組織中表達有限，在NKTCL組織中高表達，可以作為免疫治療靶標。靶向CD38治療時，臨床醫(yī)生應考慮到對高表達CD38的非靶器官造成的可能損害。該研究可為臨床藥物安全性提供參考，并幫助臨床醫(yī)生警惕高表達組織的損傷或不良反應，進行針對性的提前預防。此外，該研究結論可能為使用CD38作為免疫治療靶標提供背景支持。