吳 愷，何宏博，張 澎，曾 誠(chéng)，劉東雷，趙 松

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)道，在世界范圍內(nèi)食管癌發(fā)病率高居惡性腫瘤第7位，死亡率高居第6位[1]。其中食管鱗癌是食管癌的主要病理類(lèi)型[2]。目前，以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療仍是食管鱗癌患者最為常見(jiàn)的化療方案，但對(duì)順鉑化療的不敏感是食管鱗癌患者治療失敗的主要原因，嚴(yán)重威脅患者的生命健康，影響預(yù)后[3-4]。因此，提高食管鱗癌的順鉑化療敏感性，可提高提高食管鱗癌的臨床治療效果，改善預(yù)后。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ)是Ⅱ型核激素受體超家族的一類(lèi)由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子[5]。通常與視黃素X受體形成異二聚體并招募共抑制蛋白復(fù)合物與之結(jié)合，進(jìn)而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄；此外，也可與配體結(jié)合激活，釋放共抑制蛋白并結(jié)合輔激活蛋白，與所調(diào)節(jié)基因的啟動(dòng)子上游因子結(jié)合從而對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控，發(fā)揮生物學(xué)功能[6]。研究[7]報(bào)道，PPAR-γ可通過(guò)調(diào)控脂肪和糖代謝、能量平衡、炎癥反應(yīng)等抗肝纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善心衰、抗腫瘤等。

據(jù)研究[8]報(bào)道，在多種腫瘤細(xì)胞中均存在PPAR-γ的表達(dá)，經(jīng)配體激活后，PPAR-γ可抑制結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。有研究[9]報(bào)道PPAR-γ在食管癌和肺癌中的表達(dá)顯著降低，經(jīng)配體激活后可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，還有研究[10-11]發(fā)現(xiàn)PPAR-γ激動(dòng)劑可顯著增強(qiáng)5-Fu對(duì)人結(jié)腸癌化療的敏感性。這些研究結(jié)果均提示PPAR-γ在不同腫瘤中的功能具有多樣性。但目前有關(guān)PPAR-γ在食管鱗癌化療敏感性中的作用仍無(wú)報(bào)道?；诖?，闡明PPAR-γ在順鉑耐藥的食管鱗癌中的生物特性、對(duì)順鉑化療敏感性的影響，可為其作為靶點(diǎn)應(yīng)用于食管鱗癌的綜合治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑食管鱗癌EC109細(xì)胞購(gòu)自上海生物科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；順鉑、羅格列酮購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；MTT試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng)采用體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)EC109細(xì)胞，在37 ℃恒溫、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取生長(zhǎng)良好的處于對(duì)數(shù)期的EC109細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL(約1×104個(gè)細(xì)胞)。另設(shè)對(duì)照組、羅格列酮組(5、10、20、40 μmol/L)、順鉑組(10 μmol/L)、羅格列酮聯(lián)用順鉑組，分別于24、48、72 h后收集細(xì)胞，每孔加入15 μL MTT溶液[用磷酸鹽緩沖液(PBS)配成5 g/L]避光培養(yǎng)4 h，棄去96孔板中培養(yǎng)基，每孔加150 μL二甲亞砜，振蕩10 min，37 ℃環(huán)境中放置30 min，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處每孔吸光度值。計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞周期分布檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)處理48 h后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌1次，沉淀用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇固定過(guò)夜。離心去除固定液并用PBS洗滌1次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，加入核糖核酸酶(0.25 g/L)，37 ℃水浴30 min，加入碘化丙啶染色液至終濃度為20 mg/L，室溫避光染色10 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

1.5 荷瘤裸小鼠模型的建立及分組BALB/c，nu/nu裸小鼠，雌性，4～5周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自北京維通利華有限公司，SPF級(jí)條件下進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，離心去上清洗滌，再用培養(yǎng)基洗滌，制備成細(xì)胞懸液(1×107個(gè)/mL)，于裸小鼠后背右側(cè)皮下進(jìn)行腫瘤細(xì)胞接種(200 μL，2×105個(gè)細(xì)胞)。

接種完食管鱗癌細(xì)胞約12 d后即可形成腫瘤。將24只EC109細(xì)胞移植瘤荷瘤裸小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、羅格列酮組(3 mg/kg)、順鉑組(6 mg/kg)、羅格列酮(3 mg/kg)聯(lián)合順鉑(6 mg/kg)組。采用灌胃給藥，連續(xù)每天給藥2周，給藥量約0.2 mL，對(duì)照組給予相同體積的生理鹽水。

1.6 荷瘤裸小鼠腫瘤結(jié)節(jié)生長(zhǎng)的測(cè)定分別于治療后的第0、4、8、12和16天精密測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)的最長(zhǎng)徑(a)和最短徑(b)，根據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積V=1/6 π(ab2)，取得均值繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。于第18天處死裸鼠，精密稱(chēng)量腫瘤質(zhì)量，計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。腫瘤生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組腫瘤平均瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均瘤質(zhì)量)/對(duì)照組腫瘤平均瘤質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果

2.1 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對(duì)EC109細(xì)胞的抑制作用羅格列酮可顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)EC109細(xì)胞的抑制作用，并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(lài)性。見(jiàn)圖1。

圖1 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對(duì)EC109細(xì)胞的抑制作用

2.2 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對(duì)EC109細(xì)胞細(xì)胞周期的影響細(xì)胞周期分布分析結(jié)果顯示羅格列酮聯(lián)合順鉑使EC109細(xì)胞S期細(xì)胞顯著增多。見(jiàn)表1。

表1 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對(duì)EC109細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 %

2.3 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對(duì)EC109細(xì)胞移植瘤荷瘤裸小鼠腫瘤的影響羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對(duì)EC109細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制率分別為40.21%、52.84%、75.22%。羅格列酮聯(lián)合順鉑組小鼠腫瘤體積顯著減小。見(jiàn)圖2、表2。

表2 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對(duì)EC109細(xì)胞移植瘤荷瘤裸小鼠腫瘤質(zhì)量和生長(zhǎng)抑制率的影響

圖2 羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對(duì)EC109細(xì)胞移植瘤荷瘤裸小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線的影響

3 討論

化療是食管癌的重要基礎(chǔ)治療手段，順鉑目前是臨床治療食管鱗癌的常規(guī)一線化療藥物[2]。但許多患者在應(yīng)用以順鉑為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)化療方案后對(duì)順鉑不敏感，復(fù)發(fā)率高，易產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)一步造成食管鱗癌患者的化療失敗和死亡[3]。研究[4]報(bào)道，食管癌患者對(duì)順鉑的不敏感是一個(gè)多因素、多機(jī)制參與的復(fù)雜過(guò)程，主要與多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、微管蛋白、熱休克蛋白等密切相關(guān)。但食管鱗癌耐藥的機(jī)制仍未完全闡釋清楚。而將不同作用機(jī)制的化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可能能提高食管鱗癌的化療效果，增加其對(duì)順鉑的敏感性。

PPAR-γ作為PPARs家族的一種核轉(zhuǎn)錄因子，與相應(yīng)配體結(jié)合后可誘導(dǎo)或抑制靶基因的表達(dá)[12]。據(jù)研究[13]報(bào)道，在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌及多種消化道腫瘤中PPAR-γ均有表達(dá)。PPAR-γ可通過(guò)阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化或凋亡等抑制其生長(zhǎng)。Liang等[14]研究報(bào)道乳腺癌患者中，高表達(dá)PPAR-γ者疾病無(wú)進(jìn)展生存期更長(zhǎng)。而在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中，PPAR-γ活化可致腫瘤細(xì)胞分化并誘導(dǎo)其凋亡[15]。此外，Ogino等[16]報(bào)道PPAR-γ的表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者的臨床預(yù)后呈正相關(guān)，PPAR-γ可作為結(jié)腸癌治療效果的靶點(diǎn)。上述研究提示，PPAR-γ下調(diào)可能為腫瘤細(xì)胞耐藥的機(jī)制之一。但PPAR-γ在食管癌化療敏感性中的作用報(bào)道極少。

本研究分別從細(xì)胞水平、動(dòng)物水平探討過(guò)PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)食管癌化療敏感性的影響。結(jié)果表明：羅格列酮可顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)EC109細(xì)胞的抑制作用，并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(lài)性。細(xì)胞周期分布分析結(jié)果顯示羅格列酮聯(lián)合順鉑可使EC109細(xì)胞S期細(xì)胞顯著增多。羅格列酮、順鉑、羅格列酮聯(lián)合順鉑對(duì)EC109細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制率分別為40.21%、52.84%、75.22%羅格列酮聯(lián)合順鉑組小鼠腫瘤體積顯著減小。以上結(jié)果表明羅格列酮聯(lián)合順鉑可顯著提高食管癌化療敏感性。

綜上所述，PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮能夠顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)食管癌的化療敏感性，其機(jī)制主要與S期細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。本研究結(jié)果可為提高食管癌的臨床治療效果奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。