彭海艷， 蔣校文， 黃華慶， 陳金勇

南方醫(yī)科大學附屬郴州市第一人民院口腔科 南華大學轉化醫(yī)學研究所，湖南 郴州（423000）

牽張成骨是口腔頜面及整形外科畸形缺損的重要整復手段，具有同時延長軟、硬組織等其它整復手段不能比擬的優(yōu)勢，但治療時間長、并發(fā)癥較多等一直是限制其廣泛臨床應用的瓶頸［1-2］。探討對牽張力最敏感的應答細胞和新骨生成的主要細胞—骨髓間充質細胞（bone marrow mesenchymal cells，BMMSCs）在牽張成骨過程中的具體機制對于豐富牽張成骨的分子機制及研究治療靶點具有重要意義。多單元細胞拉伸裝置能夠對細胞施加周期性的牽張力，并具有易控制、易重復的特點，是體外研究牽張力對細胞影響的較好模型［3-4］。

近年來研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin，mTOR）信號通路在骨發(fā)育及病理生理中具有重要的作用［5，6］。其中研究較多的哺乳動物雷帕霉素復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信 號 通 路 主 要 由mTOR、mTOR 相關調節(jié)蛋白（Raptor）和mTOR 必須蛋白亞基帶SEC13 哺乳動物致死蛋白8（mammalian lethal SEC13 protein 8，mLST8）組成，能接受激素、生長因子、營養(yǎng)及能量、應激等刺激，并對大環(huán)內酯藥物雷帕霉素（rapamycin）敏感［7］，但其在牽張成骨方面的研究較少。本實驗以多單元細胞拉伸裝置為平臺對小鼠BMMSCs 施加周期性單軸牽張力后觀察內源性mTORC1 信號通路的表達變化規(guī)律，同時通過工具藥改變內源性mTORC1 信號通路的表達來探討該通路對張應力下BMMSCs 成骨的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗動物為1 月齡雄性小鼠（SYXK < 湘 >2010-0006，南華大學動物實驗中心），本研究獲得郴州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準（N2015094562）。多單元細胞拉伸裝置（四川大學）；分光光度儀（羅氏，瑞士）。Percoll 分離液（Phamacia，美國）；LG-DMEM 培養(yǎng)基（Gibico，美國）；Ⅰ型鼠尾膠（ABI，美國）；BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo，美國）；ALP 試劑盒（建成，中國）；OCN試劑盒（BIM，美國）；mTOR 一抗（Abcam，英國）；pmTOR 一抗（Abcam，英國）；GAPDH 一抗（Santa-Cruz，美國）；Raptor 一抗（Cell Signaling，美國）；p-Raptor 一抗（Cell Signaling，美國）；S6K 一抗（Cell Signaling，美國）；p-S6K 一抗（Cell Signaling，美國）；Trizol 試劑盒（Gibico，美國）；PP242（Cayman，美國）；MHY1485（MedChemExpress，美國）。

1.2 小鼠BMMSCs 的分離和培養(yǎng)

無菌條件下分離1 月齡雄性小鼠雙側股骨和脛骨，剪開干骺端用培養(yǎng)基沖出骨髓，離心棄去脂肪層后吹打制成細胞懸液，加入Percoll 分離液后離心吸取界面細胞層，用含5%胎牛血清的PBS 溶液洗滌細胞3 次后棄上清，加入10%胎牛血清的LG-DMEM 培養(yǎng)基吹成細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶內，培養(yǎng)2 d 后更換培養(yǎng)基，倒置顯微鏡下觀察當細胞融合達70%～80%時用0.25%的胰蛋白酶消化細胞傳代，選用第3 代細胞計數(shù)后進行下一步實驗，每個檢測指標收集8 個樣本行檢測。

1.3 細胞加力及分組

將高溫高壓滅菌后均勻涂布1.5 mL（0.012 μg/mL）Ⅰ型鼠尾膠的硅膠膜組裝到細胞培養(yǎng)單元上，同時在硅膠膜上放置硅膠膜矩形環(huán)（40 × 30 mm）以控制細胞接種范圍，將2 mL 密度為2 × 104個/mL 的細胞懸液接種于硅膠膜上后在37 ℃體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后取出硅膠膜矩形環(huán)，補加含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基10 mL 培養(yǎng)24 h，更換無血清培養(yǎng)基同步化12 h 后利用多單元細胞拉伸裝置（四川大學）施加10%形變量的單軸動態(tài)牽張力2 h（頻率為0.2 Hz）。裝置見圖1。

Figure 1 The photo of the multi-unit cell stretching device圖1 多單元細胞拉伸裝置實物圖

在同步化階段及加力階段加力單元中，設立mTORC1 信號通路抑制組（加入PP242 100 nM）、對照組（加入等體積PBS）和mTORC1 信號通路激活組（加入MHY1485 10 μM），加力結束后2 h 收集培養(yǎng)液及細胞進行下一步研究。

1.4 mTORC1 信號通路及成骨信號的檢測

1.4.1 化學比色法檢測細胞堿性磷酸酶（alkalinephosphate，ALP）活性［4］將硅膠膜上的單純加力五組細胞分別PBS 洗滌、胰酶消化，與3 ml 帶血清培養(yǎng)基混勻，離心棄上清，再加入2 ml PBS 經過混勻離心棄上清，最后加入90 μl PBS 液收集細胞。將細胞反復凍融3 次，離心后收集上清液50 μl 加入試劑盒中基質液和緩沖液各500 μl，混勻后37 ℃水浴15 min 后加入顯色劑1.5 ml 混勻后，利用分光光度儀檢測其405 nm 波長下吸光度值，根據(jù)公式［y＝2000（Δx-Δ空白）/18.5］計算出ALP 活性，結果以U/ml 表示。

1.4.2 ELISA 法測定骨鈣素（osteocalcin，OCN）含量［4］使用標準品450 nm 波長下測量后計算出標準曲線的直線回歸方程。將單純加力五組細胞培養(yǎng)皿內培養(yǎng)液1 ml 離心后收集上清作為待測標本，在酶標包被板中入待測樣本10 μl，再加樣本稀釋液40 μl 混勻后37 ℃溫育30 min，棄液洗板五次后甩干，加入酶標工作液50 μl，37 ℃溫育 30 min后棄液洗板五次甩干后再加入顯色劑50 μl 混勻，37 ℃避光顯色 15 min 后加終止液 50 μl 終止反應后檢測其 450 nm 波長下比值，通過方程［1］（y＝3.654x+1.029）計算出培養(yǎng)液內OCN 相對濃度。

1.4.3 Western blot 測定mTORC1 信號通路主要分子（mTOR、Raptor 以及S6K）表達 將硅膠膜上的單純加力五組細胞裂解后得到總蛋白，以牛血清為標準品，利用BCA 蛋白定量試劑盒建立標準曲線，計算總蛋白濃度，取總蛋白20 μg 行SDS-PAGE電泳，轉PVDF 膜，脫脂奶粉封閉后分別一抗工作液孵育過夜后二抗工作液37 ℃孵育1 h 置于自動成像儀暗匣中加顯影液，計算機掃描收集圖像，檢測 mTOR、p-mTOR、Raptor、p-Raptor、S6K 及 p-S6K蛋白表達水平，GAPDH 作為內參。

1.4.4 Real-time PCR 測定 Runx2 mRNA 水平 將硅膠膜上的單純加力五組細胞按Trizol 試劑盒流程提取細胞中總RNA，通過異丙醇沉淀法濃縮RNA，進一步對總RNA 行過柱純化。RT-PCR 測定Runt 相關轉錄因子2（Runt-related Transcription Factor 2，Runx2）mRNA（5'端引物為：5'-CCCAGCCACCTTTACCTACA-3'，3'端引物為：5'-TATGGAGTGCTGCTGGTCTG-3'），以 GAPDH 為內參（5'端引物為：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，3'端引物為：5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'）。采用反轉錄試劑盒在BioRad 1000 TM 上反轉錄成cDNA。再以第一鏈cDNA 為模板，采用SYBR Green I 染料進行實時熒光定量RT-PCR 反應。PCR擴增條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，共 40個循環(huán)，72 ℃延伸7 min 后結束擴增反應，取擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳結果。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 單純細胞加力后內源性mTORC1 信號通路及成骨信號的檢測

2.1.1 牽張后細胞mTORC1 信號通路激活 Western blot 結果顯示，牽張結束后0～8 h 后細胞均表達 mTOR、Raptor、S6K 信號，通過對磷酸化上述因子的檢測發(fā)現(xiàn)，細胞中的p-mTOR、p-Raptor 與p-S6在牽張結束后表達逐漸上升（0～2 h），在2 h 時表達最高值。2 h 后，上述蛋白表達逐漸下降。見圖2。

Figure 2 The expression of the major signal molecule protein of mTORC1 signal pathway of BMMSCs at 0-8 hours after the application of 10%uniaxial dynamic tensile force for 2 hours圖2 施加形變量10%單軸動態(tài)牽張力作用2 h后0-8 h mTORC1 主要信號分子蛋白表達情況

2.1.2 成骨信號表達變化趨勢與mTORC1 信號通路一致 細胞牽張結束后0～8 h 后，化學比色法檢測結果顯示，ALP 的活性在0～2 h 逐漸升高，2 h時達到最高值，2～8 h 呈下降趨勢。ELISA 法檢測OCN 含量以及 Real-time PCR 檢測 Runx2 mRNA 水平的結果顯示，OCN、Runx2 趨勢與ALP 一致，均出現(xiàn)先上升后下降趨勢。見表1、圖3。

2.2 內源性mTORC1 信號通路變化后細胞成骨信號的改變

2.2.1 mTORC1 信號通路被抑制或激活 由western blot 結果可見，牽張應力作用結束2 h 后，與對照組相比，mTOPC1 通路抑制組的p-S6K 表達下降，而增強組p-S6K 表達上升，說明抑制組內源性mTOR 信號被抑制，增強組內源性mTOR 信號被增強（圖4）。

2.2.2 抑制或增強mTORC1 通路可調節(jié)細胞成骨信號的表達 化學比色法檢測結果顯示，與對照組相比，mTORC1 抑制組的ALP 的活性降低（P<0.001），而增強組ALP 活性升高（P<0.001）；ELISA法檢測OCN 相對含量，與對照組相比，抑制組的相對含量下降（P< 0.001），增強組則升高（P<0.001）；同樣地，Real-time PCR 檢測 Runx2 mRNA 水平的結果顯示，抑制組的水平下降（P< 0.001），增強組水平升高（P<0.001）。見表2。

表1 施加形變量10%單軸動態(tài)牽張力作用2 h 后0～8 h BMMSCs 成骨信號結果Table 1 The osteogenic signal data results of BMMSCs after the application of 10%uniaxial dynamic tensile force for 2 hours from 0 to 8 h

Figure 3 The PCR electrophoresis results of BMMSCs after the application of 10%uniaxial dynamic tensile force for 2 h from 0 to 8 h圖3 施加形變量10%單軸動態(tài)牽張力作用2 h 后0 至 8 h BMMSCs Runx2 PCR 電泳結果

3 討 論

Figure 4 The expression of p-S6K protein among three BMMSCs groups 2 h after the application of uniaxial dynamic tensile force圖4 3 組BMMSCs 加力結束后2 h p-S6K 蛋白表達情況

表2 3 組BMMSCs 加力結束后2 h 成骨信號表達情況Table 2 The expression of osteogenic signal at 2 hours after the end of BMMSCs in three groups ±s

表2 3 組BMMSCs 加力結束后2 h 成骨信號表達情況Table 2 The expression of osteogenic signal at 2 hours after the end of BMMSCs in three groups ±s

Groups Inhibited group Control group Activated group F P ALP（U/ml）113.060±26.102 150.170±21.199 186.356±29.144 16.280<0.001 OCN（U）0.939±0.154 1.329±0.291 1.950±0.314 30.314<0.001 Runx2（E）0.875±0.172 1.431±0.262 1.950±0.314 35.376<0.001

mTOR 是一種保守的絲/蘇氨酸蛋白質激酶，在細胞多種生理活動的調控中處于核心地位，使得mTOR 信號通路成為近年基礎與臨床研究的熱點［7-8］。mTOR 需要在細胞內與其它分子形成復合物而保持生物學活性，目前發(fā)現(xiàn)主要有兩種復合物：mTORCl 和mTORC2。其中研究較多的是mTORCl由mTOR、Raptor 和mLST8，該信號通路蛋白能接受激素、生長因子、應激等刺激，并對rapamycin 敏感［7］。S6K 和真核細胞翻譯啟始因子4E 結合蛋白l是mTORCl 的主要效應分子。 近年來發(fā)現(xiàn)mTORC1 信號通路在成骨過程中起著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)mTORC1/Raptor 是早期成骨分化所必需的因子［9］，并通過促進Runx2 表達來誘導成骨發(fā)育［10］。但在大鼠骨折模型及小鼠轉基因動物模型發(fā)現(xiàn)抑制mTOR 信號卻能夠促進成骨［11-14］。

本研究發(fā)現(xiàn)在形變量為10%的單軸周期牽張力下mTORCl 信號通路的主要信號分子（mTOR、Raptor、S6K）在加力后8 h 內均能被檢測，并且發(fā)現(xiàn)具有活性的磷酸化分子的表達有動態(tài)表達，均在2 h 達到峰值后逐漸下降，這與檢測到成骨指標（ALP、OCN 和Runx2）具有相似的表達變化。Zeng等［15］發(fā)現(xiàn)周期性張應力能夠通過激活mTOR/S6k信號通路促進人成骨樣細胞的能量代謝。另外，有研究使用大鼠下頜骨牽張模型發(fā)現(xiàn)，p-mTOR 陽性表達升高；對體外培養(yǎng)下頜骨來源BMMSCs 使用Flexcell 加力（6%）模擬牽張成骨發(fā)現(xiàn)mTOR、Raptor、p70S6k 等基因水平明顯升高。這與本研究結果相似，說明mTORCl 信號通路參與了細胞張應力下成骨過程中。為了進一步研究其在該過程中的作用，本研究利用MHY1485（細胞滲透性mTOR 激動劑）和PP242（通過阻斷細胞中負反饋、激活AKT途徑來抑制mTORC1 和mTORC2 的新型抑制劑）改變內源性mTORCl 信號表達強度，通過對mTORCl信號下游主要效應分子S6K 表達發(fā)現(xiàn)工具藥能夠增強或抑制內源性mTORCl 信號的表達。隨后發(fā)現(xiàn)mTORCl 信號被抑制后成骨信號也明顯減弱，而激活該信號后成骨活性明顯增強，提示mTORCl 信號通路在張應力下細胞成骨的過程中處于核心地位。下一步通過對mTORCl 信號通路在細胞張應力下成骨中的具體分子機制的研究不僅能夠完善牽張成骨的機制，也有望成為治療牽張成骨的靶點之一。