武東輝， 朱韻瑩， 梁堅(jiān)強(qiáng)， 林釗宇， 李勁松

1. 廣州市海珠區(qū)口腔醫(yī)院口腔外科，廣東 廣州（510120）； 2. 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院口腔頜面外科，廣東廣州（510220）

腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是唾液腺最常見的惡性腫瘤，主要來自唾液導(dǎo)管上皮，占惡性唾液腺腫瘤的四分之一。唾液腺腺樣囊性癌具有神經(jīng)浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移等特征［1-3］，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響唾液腺腺樣囊性癌患者的重要預(yù)后因素［4，5］。因此，探究 SACC 的神經(jīng)侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)提高SACC 患者的存活率有重要意義。目前發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)非編碼RNA（longnocoding RNA，lncRNA）在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展起重要作用，本研究主要研究lncRNA 在SACC 侵襲、轉(zhuǎn)移過程中是否起到重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SACC-83 和SACC-LM 細(xì)胞購(gòu)自北京大學(xué)；SACC-LM 為源自SACC-83 肺轉(zhuǎn)移的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系。10%FBS（Invitrogen，美國(guó)）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；人類lncRNA 微陣列V3.0 芯片（上海博豪生物公司，中國(guó)）；TRIzol 試劑（Invitrogen，美國(guó)）；Prime Script TM RT 試劑盒（Takara Biotechnology，日本）；LightCycler 480 系統(tǒng)（Roche，瑞士）；Lipofectamine 3000 脂質(zhì)體（Invitrogen，美國(guó)）；Transwell小室（BD Biosciences，美國(guó)）。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SACC-83 和SACC-LM 細(xì)胞分別在含有10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃，5%CO2。

1.2.2 lncRNA 微陣列分析 使用人類lncRNA 微陣列V3.0 進(jìn)行分析對(duì)SACC-83 和SACC-LM 細(xì)胞進(jìn)行比較分析（該部分由上海博豪生物公司負(fù)責(zé)完成）。

1.2.3 RNA 提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用TRIzol 試劑從組織或細(xì)胞中提取總RNA，并使用Prime Script TM RT 試劑盒同時(shí)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用LightCycler 480 系統(tǒng)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)，并將ADAMTS9-AS2 的相對(duì)表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：ADAMTS9 - AS2：forward 5' - TTTACCATGCGCTGAGTGAG-3'，reverse 5'-AAAGTTGCGTCATGCTTCGG-3'；GAPDH：forward 5'- ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'，reverse 5'-GAGGCAGGGATGATGTTCTG-3'。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 芯片結(jié)果顯示長(zhǎng)非編碼RNA ADAMTS9-AS2 的表達(dá)在SACC-LM 中表達(dá)最高，靶向lncRNA 的siRNA ADAMTS9-AS2 以及對(duì)照siRNA由廣州銳博公司合成提供。使用Lipofectamine 3000 脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，siRNA 最終濃度為50 nM，根據(jù)說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通過qRT-PCR 檢測(cè)沉默效率。

1.2.5 侵襲遷移實(shí)驗(yàn) ①遷移實(shí)驗(yàn)：消化并收集1× 105個(gè)腫瘤細(xì)胞加入到無(wú)血清培養(yǎng)基中，將200 μl 該細(xì)胞加到Transwell 小室的上室內(nèi)，而下室中加入500 ul 含10% FBS 的完全培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h 后，將小室放入4%多聚甲醛中固定10 min，隨后浸入0.05%結(jié)晶紫溶液中染色2 min，擦去小室上層的細(xì)胞，PBS 沖洗后使用正置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。每個(gè)小室選取5 個(gè)視野拍照，所計(jì)細(xì)胞數(shù)取均值。②細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel（無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋）溶解后，向Transwell 小室上室中加入50 μl，室溫孵育1 h。隨后消化重懸舌鱗癌細(xì)胞，將1 × 105個(gè)細(xì)胞接種于小室上層，下層加入500 ul 含10%FBS 的完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)30 個(gè)小時(shí)，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 差異表達(dá)的lncRNA 與SACC 患者的臨床病理特征和預(yù)后分析 SACC 患者為2003 年6 月至2017 年10 月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院口腔頜面外科就診治療的唾液腺腺樣囊性癌患者共102 例，其中男女各51 例，年齡35～82 歲。所有患者術(shù)前均未接受任何化療或放療，病理確診為腺樣囊性癌。其腫瘤標(biāo)本及腫瘤邊界外約2 cm 的癌旁組織標(biāo)本存放于液氮保存。所有患者采用電話及復(fù)診的方式進(jìn)行隨訪。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量、正態(tài)分布數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 芯片篩選SACC 細(xì)胞系內(nèi)差異表達(dá)的lncRNA及qRT-PCR 驗(yàn)證

為了揭示lncRNA 對(duì)SACC 轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)使用lncRNA 芯片篩選SACC-LM 和SACC-83細(xì)胞中差異表達(dá)的lncRNAs（差異倍數(shù)＞2）并繪制熱圖（圖1a）。為了驗(yàn)證芯片結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR 進(jìn)行驗(yàn)證差異表達(dá)的候選lncRNA 在SACC-LM 和SACC-83 細(xì)胞中的表達(dá)水平（圖1b）。芯片結(jié)果顯示lncRNA ADAMTS9-AS2 的表達(dá)在SACC-LM 中表達(dá)最高，qRT-PCR 進(jìn)一步驗(yàn)證了其在SACC-LM 中的高表達(dá)。

a: heat map depicting lncRNAs for which a two fold change in expression was found in the SACC-LM and SACC-83 cells; b:the expression levels of several significantly differentially expressed lncRNAs were validated by qRT-PCRFigure 1 Microarray screening of lncRNA differentially expressed in SACC cell lines and validation of qRT-PCR圖1 芯片篩選SACC 細(xì)胞系內(nèi)差異表達(dá)的lncRNA 及qRT-PCR 驗(yàn)證

2.2 敲低ADAMTS9-AS2 抑制SACC 細(xì)胞遷移和侵襲

為了驗(yàn)證ADAMTS9-AS2 對(duì)SACC 細(xì)胞遷移和侵襲功能的調(diào)控作用，設(shè)計(jì)了兩條靶向ADAMTS9-AS2 的 siRNAs 并將該 siRNAs 轉(zhuǎn)入 SACC-LM 細(xì)胞內(nèi)，通過qRT-PCR 檢測(cè)沉默效率（圖2）。此外，Transwell 結(jié)果顯示敲低ADAMTS9-AS2 的表達(dá)后，侵襲和遷移的SACC-LM 細(xì)胞數(shù)目顯著降低（圖3）。

2.3 ADAMTS9-AS2 與SACC 患者的臨床病理特征和預(yù)后分析

檢測(cè)lncRNA ADAMTS9-AS2 在SACC 及癌旁樣本的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADAMTS9-AS2 在SACC 組織內(nèi)顯著高表達(dá)，此外ADAMTS9-AS2 在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的SACC 患者中的表達(dá)較未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者顯著上調(diào)（圖4）。

Figure 2 The ADAMTS9-AS2 levels were examined in the SACC-LM cells transfected with siRNAs targeting ADAMTS9-AS2 or siRNA controls圖 2 qRT-PCR 檢測(cè) ADAMTS9-AS2 siRNAs 在SACC-LM 細(xì)胞內(nèi)的沉默效率

Figure 3 The SACC-LM cells transfected with siR-ADAMTS9-AS2 were subjected to chamber assays圖3 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ADAMTS9-AS2 敲低后SACC-LM 細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化

*P＜0.05,**P＜0.01Figure 4 The ADAMTS9-AS2 expression levels were detected by qRT-PCR in the clinical SACC patients with metastasis or without metastasis and adjacent normal salivary tissues圖4 qRT-PCR 驗(yàn)證ADAMTS9-AS2 在癌旁正常組織，發(fā)生轉(zhuǎn)移以及未轉(zhuǎn)移的臨床樣本中表達(dá)情況

ADAMTS9-AS2 表達(dá)與SACC 患者的臨床病理特征之間的關(guān)系見表1。 ADAMTS9-AS2 表達(dá)與SACC 患者的腫瘤大小（P＝0.017），臨床分期（P＝0.033）和是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P＝0.035）及預(yù)后（P< 0.001）密切相關(guān)。而ADAMTS9-AS2 表達(dá)與SACC 患者的性別或年齡未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

目前發(fā)現(xiàn)多種lncRNA 參與多種腫瘤生物功能的調(diào)控，包括增殖、凋亡、自噬、遷移和侵襲，是后基因組時(shí)代的重要發(fā)現(xiàn)［6-7］，lncRNA 的異常表達(dá)通過順式或者反式作用參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可能成為腫瘤輔助診斷或治療的新靶點(diǎn)［8-11］。

表1 ADAMTS9-AS2 表達(dá)與102 例SACC 患者的臨床病理特征之間的關(guān)系Table 1 Correlation of clinicopathologic status and the expression of lncRNA ADAMTS9-AS2 in the SACC patients

由于目前對(duì)lncRNA 在SACC 侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用研究甚少，本研究初步探討lncRNA 是否參與調(diào)控SACC 發(fā)生發(fā)展，篩選出促進(jìn)SACC 侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵lncRNA，為進(jìn)一步的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。本研究使用lncRNA 表達(dá)譜芯片來篩選SACC 肺轉(zhuǎn)移株SACC-LM 細(xì)胞和原發(fā)灶SACC-83 細(xì)胞中的lncRNA 表達(dá)譜。lncRNA 表達(dá)譜芯片及 qRT-PCR 結(jié)果顯示，lncRNA ADAMTS9-AS2 是 SACC-LM 細(xì)胞內(nèi)上調(diào)最明顯的lncRNA，ADAMTS9-AS2 是蛋白質(zhì)編碼基因 ADAMTS9 的反義轉(zhuǎn)錄物［12］，在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系SACC-LM 細(xì)胞內(nèi)上調(diào)表明其在SACC 的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用，它的表達(dá)水平可能與SACC 侵襲、轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。通過敲低ADAMTS9-AS2，SACC-LM 細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著下降，提示在SACC 的侵襲轉(zhuǎn)移過程中，ADAMTS9-AS2 可能扮演了重要角色，它的高表達(dá)提高了SACC-LM 遷移和侵襲能力。SACC 患者臨床病理特征顯示，lncRNA ADAMTS9-AS2 是 SACC 組織上調(diào)明顯的lncRNA，腫瘤體積大、臨床分期晚，則ADAMTS9-AS2 表達(dá)水平高，提示ADAMTS9-AS2的高表達(dá)參與促進(jìn)了SACC 的發(fā)生發(fā)展過程。在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例中，ADAMTS9-AS2 呈高表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明ADAMTS9 -AS2 在SACC 侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。一般情況下，腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移性越強(qiáng)，則腫瘤患者的預(yù)后就越差，ADAMTS9-AS2 高表達(dá)，相應(yīng)患者的預(yù)后就越差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ADAMTS9-AS2 可能可以成為SACC 預(yù)后不佳的標(biāo)志物之一。但也有研究表明，ADAMTS9-AS2 在某些種類的腫瘤中卻起到了不同的作用，例如ADAMTS9-AS2 在肺癌低表達(dá)，它通過PI3K/Akt 途徑抑制肺癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲［13］。高表達(dá)的 ADAMTS9-AS2 通過 miR-223-3p/TGFβR3 軸抑制卵巢癌發(fā)生發(fā)展［14］，與本研究的結(jié)果不一致，可能ADAMTS9-AS2 在不同腫瘤中其生物學(xué)功能不同。有研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS9-AS2 發(fā)揮競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA 作用，直接靶向miRNA 及其靶基因以促進(jìn)頭頸癌進(jìn)展［15］，比如 miR-600/EZH2 可以抑制腫瘤進(jìn)展，在舌鱗癌中，ADAMTS9-AS2 與miR-600 內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)EZH2，而起到促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用［16］。

本研究證實(shí)了lncRNA ADAMTS9-AS2 在發(fā)生轉(zhuǎn)移的SACC 樣本和高轉(zhuǎn)移潛力的SACC-LM 細(xì)胞內(nèi)特異性高表達(dá)，ADAMTS9-AS2 的表達(dá)與SACC 的預(yù)后及臨床病理特征密切相關(guān)。下一步將重點(diǎn)研究ADAMTS9-AS2 內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA 比如miR-600/EZH2 等的具體機(jī)制，來進(jìn)一步闡明ADAMTS9-AS2促進(jìn)SACC 腫瘤發(fā)生發(fā)展侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。