蘭 慧，陽(yáng) 敬＊＊，李姝梅，趙榮華

（1. 紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院 蒙自 661199；2. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 昆明 650500）

大黃素（Emodin）是一種重要的天然藥物成分，化學(xué)名為1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌（1,3,8-trihydroxy-6-methylanthra quinone）屬蒽醌類成分[1]，大黃素又稱朱砂蓮甲素[2]，主要來(lái)源于蓼科的大黃、何首烏、虎杖以及豆科的決明等植物中，是大黃、何首烏藥材的質(zhì)量控制成分。大黃素在多種植物中含量高，提取精制容易，具有抗菌、抑制免疫、解痙、止咳和抗癌等藥理作用[2]。為了進(jìn)一步提高大黃素生物活性，發(fā)現(xiàn)新用途，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外以大黃素作為前體藥進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)合成了許多活性較好的大黃素衍生物。

近年來(lái)，生物轉(zhuǎn)化方法具有選擇性強(qiáng)、副產(chǎn)物少，反應(yīng)條件溫和，污染環(huán)境小等特點(diǎn)，已成為結(jié)構(gòu)修飾的重要手段。微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)與化學(xué)轉(zhuǎn)化相比，無(wú)論在轉(zhuǎn)化速度還是轉(zhuǎn)化質(zhì)量等方面均表現(xiàn)出了顯著優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于天然藥物成分的合成轉(zhuǎn)化和代謝機(jī)理研究[3]，生物轉(zhuǎn)化也稱發(fā)酵。目前，中藥成分的微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化技術(shù)是人類獲得結(jié)構(gòu)新穎、獨(dú)特、低成本、低毒性和高活性藥物的重要途徑之一[4]。發(fā)酵應(yīng)用于中藥，能利用微生物分解轉(zhuǎn)化能力，改變中藥原有性能，增強(qiáng)或產(chǎn)生新的功效，擴(kuò)大用藥品種，使得中藥更適應(yīng)于臨床用藥的需要[5]。

中藥微生物發(fā)酵主要有2 種方式：固體發(fā)酵和深層發(fā)酵（液體發(fā)酵）。固體發(fā)酵是指利用微生物在潮濕的沒(méi)有自由流動(dòng)水的固體基質(zhì)上生長(zhǎng)代謝的技術(shù)[6-7]。固體發(fā)酵歷史悠久，是一種比較成熟的發(fā)酵方式，操作和所需設(shè)備簡(jiǎn)單[8]。如以玉米為底物，采用Shiraia sp.SUPER-H168進(jìn)行固體發(fā)酵，能夠大量產(chǎn)生竹紅菌素A[9]。秦俊哲等[10]用中藥渣代替?zhèn)鹘y(tǒng)原料進(jìn)行靈芝固體發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其固體菌絲中多糖含量和氨基酸含量都大大提高，不僅提高了藥效，而且節(jié)約了藥用資源。國(guó)外固態(tài)發(fā)酵在酶的生產(chǎn)[11-13]等方面己顯示了良好的應(yīng)用前景。近年來(lái)，對(duì)固態(tài)發(fā)酵原理和應(yīng)用的研究使得清潔、節(jié)能的固態(tài)發(fā)酵已然成為發(fā)酵工業(yè)的關(guān)注熱點(diǎn)[14]。固態(tài)發(fā)酵已引起很大的重視，因?yàn)檫@種生物過(guò)程可有效地轉(zhuǎn)換廉價(jià)的農(nóng)工業(yè)廢渣、植物和各種各樣有價(jià)值的化合物[15]。由于藥物具有不同的特性，因此，研究人員能夠根據(jù)藥物之間的差異性進(jìn)行有目的的組合，采用單一或混合菌種來(lái)進(jìn)行微生物的定向發(fā)酵，或定向改變藥物的性能[16]。

我國(guó)早在4000 多年前就開始將真菌轉(zhuǎn)化食品和中藥炮制等。中國(guó)傳統(tǒng)的中藥，如六神曲、淡豆豉、半夏曲、紅曲、豆黃等，均是通過(guò)利用自然界的微生物（如霉菌、酵母等）固態(tài)轉(zhuǎn)化后而形成的藥物。我國(guó)是世界上最早直接利用真菌防病治病的國(guó)家，早在東漢年間的《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有靈芝、茯苓、豬苓、雷丸等藥用真菌分別列項(xiàng)論述，至今沿用不衰。真菌具有分解纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)、脂類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的強(qiáng)大酶類，對(duì)天然培養(yǎng)基有較強(qiáng)的分解利用能力[17]。目前，單株菌應(yīng)用于中藥比較多見，如游松等[18]采用多個(gè)菌株對(duì)白藜蘆醇苷進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化研究，篩選后獲得一株絲狀真菌Syncephalastrum racemosum3.264，該菌能將白藜蘆醇苷高效轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，純化后白藜蘆醇純度高達(dá)98%。董悅生等[19]利用哈茨木霉CGMCC 2979直接轉(zhuǎn)化藥材，將梔子中的京尼平苷轉(zhuǎn)化為京尼平，48 h京尼平苷的轉(zhuǎn)化率為97.8%。馬超等[20]用酵母轉(zhuǎn)化大黃結(jié)合型蒽醌得到游離型蒽醌，從而減輕大黃的峻烈瀉下作用。杜晨暉等[21]用米根霉生物轉(zhuǎn)化何首烏及大黃素得到化合物大黃素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，并發(fā)現(xiàn)后者抑菌效果比前者好。朱培芳等[22]運(yùn)用從生長(zhǎng)何首烏的土壤中分離的一株鐮孢霉屬（Fusarium）菌株轉(zhuǎn)化何首烏及大黃素得到化合物ω-羥基大黃素。

混合菌廣泛存在于大自然中，是一類重要的微生物，對(duì)藥物的生物轉(zhuǎn)化作用強(qiáng)大，且生物轉(zhuǎn)化作用機(jī)理比單株菌復(fù)雜，是多環(huán)節(jié)對(duì)多成分的作用，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。目前，單株菌應(yīng)用于中藥及化學(xué)成分比較多見，而混合菌應(yīng)用于中藥及化學(xué)成分的研究相對(duì)較少。許多化學(xué)過(guò)程通過(guò)單酶（細(xì)胞）一步生物催化反應(yīng)往往無(wú)法實(shí)現(xiàn)，因而目前生物催化已從先前單酶（細(xì)胞）催化體系向著多酶（細(xì)胞）耦合催化體系的方向發(fā)展，構(gòu)建和利用這種體系，在同一反應(yīng)器中自由組合不同的生物反應(yīng)過(guò)程將是下一代工業(yè)生物催化技術(shù)發(fā)展所面臨的挑戰(zhàn)之一。

混合菌用于纖維素發(fā)酵已取得一定的研究成果。謝瓊霞等[23]利用多種分解纖維素的菌種進(jìn)行混合發(fā)酵甜高粱秸稈可使其降解率最高，糖化率達(dá)到3.19 mg·mL-1。張建強(qiáng)等[24]用混合菌發(fā)酵可提高纖維素的降解能力，從土壤樣品中分離、篩選出一組對(duì)纖維素具有高效降解作用的混合菌，初步鑒定為毛霉菌（Mucor sp.）和曲霉菌（Aspergillus sp.）。魏培蓮[25]運(yùn)用土曲霉和紅曲霉混合固態(tài)發(fā)酵，提高固態(tài)基質(zhì)中的生物量和洛伐他汀的產(chǎn)量?；旌暇糜谥兴幇l(fā)酵已有相關(guān)報(bào)道，石鴻輝等[7]以黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種進(jìn)行固態(tài)好氧發(fā)酵，在相同條件下比較單一菌種或混菌組合對(duì)辣木莖葉粉的營(yíng)養(yǎng)成分、抗?fàn)I養(yǎng)成分及抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，混菌發(fā)酵的效果優(yōu)于單一菌種。此外，還有一些專利如中藥多菌種混合發(fā)酵口服液的配制及其生產(chǎn)工藝，中藥多菌種混合固態(tài)發(fā)酵技術(shù)及其應(yīng)用。

目前，對(duì)單菌與混合菌生物轉(zhuǎn)化大黃素的比較研究鮮有報(bào)道，本研究將單菌與混合菌固態(tài)生物轉(zhuǎn)化大黃素進(jìn)行比較研究，為提高中藥材中大黃素微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)率提供一種選擇，為大黃素單菌與混合菌轉(zhuǎn)化奠定一定的數(shù)據(jù)支持與理論基礎(chǔ)，為大黃素及中藥材中大黃素微生物轉(zhuǎn)化提供一種新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 菌種

菌種58 株，26 組混合菌（由云南大學(xué)微生物研究所提供44 株，由成都微生物研究所提供1 株，由本實(shí)驗(yàn)室提供8 株，由自行分離提供5 株，本實(shí)驗(yàn)室保存的菌株）?；罨蠼臃N到PDA 斜面培養(yǎng)基，0℃-4℃保存。

1.2 試劑與儀器

大黃素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)0756-200110，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；大黃素（批號(hào)為060803，純度為98.07%，西安中鑫生物技術(shù)有限公司）；ω-羥基大黃素（實(shí)驗(yàn)室分離，純度達(dá)到95%）；麩皮（市售）。高效液相色譜儀（Dionex Ultimate 3000 系列，USA）：Dionex P680 四元梯度泵、Dionex ASI-100 自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、Dionex PDA-100 二極管陣列檢測(cè)器、Dionex LPG-3400 真空在線脫氣機(jī)、Dionex TCC-100 柱溫箱、Chromeleon 6.8色譜工作站；島津十萬(wàn)分之一電子天平（Auw220D，島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）；SK7210HP 超聲振蕩器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；Agilent TC-C18（4.6 × 250 mm，5 μm，USA）。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 斜面培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2.0%，瓊脂1.5%，pH自然。

1.3.2 發(fā)酵種子培養(yǎng)基

發(fā)酵種子培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2.0%，pH自然。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：大黃素0.25%，麩皮99.75%，pH自然。

1.4 大黃素和大黃素發(fā)酵物中大黃素、ω-羥基大黃素含量測(cè)定[22]

1.4.1 大黃素對(duì)照品及ω-羥基大黃素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別精密稱取大黃素對(duì)照品，ω-羥基大黃素對(duì)照品，加適量甲醇溶解，定容后作為對(duì)照品溶液。大黃素、ω-羥基大黃素對(duì)照品溶液的濃度分別為0.28 mg·mL-1、0.342 mg·mL-1。根據(jù) 2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》HPLC 測(cè)定大黃素的方法，并建立HPLC 測(cè)定大黃素及ω-羥基大黃素的方法學(xué)考察，大黃素對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = 57670X-2.6751，相關(guān)系數(shù)為0.9999，線性范圍（mg）為2.8 × 10-3-8.4 × 10-3；ω-羥基大黃素對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y = 61316X + 1.0387，相關(guān)系數(shù)為0.9999，線性范圍（mg）為1.71×10-5-3.42×10-3。

1.4.2 大黃素和大黃素發(fā)酵物中大黃素、ω-羥基大黃素含量測(cè)定方法

樣品處理：稱取上述大黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物1.0 g 加入10 mL 甲醇，稱重，超聲振蕩30 min，甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾紙過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，以0.45 μm 濾膜濾過(guò)，取過(guò)濾液作為測(cè)定大黃素固態(tài)轉(zhuǎn)化樣品的供試品溶液。按上述方法，同時(shí)制備不加入大黃素的陰性空白對(duì)照品溶液。

大黃素、ω-羥基大黃素含量測(cè)定：利用Dionex Ultimate 3000自動(dòng)進(jìn)樣器的自動(dòng)吸液-混合-進(jìn)樣功能（Draw-Mix-Inject），吸取樣品液，然后吸取純甲醇液適量，按色譜條件流動(dòng)相：A：甲醇，B：0.1%磷酸溶液，流速：1 mL·min-1，柱溫：30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，記錄時(shí)間：25 min 測(cè)定，使進(jìn)樣量保持在20 μL，各個(gè)成分制備6 個(gè)濃度點(diǎn)（n=6），每個(gè)濃度進(jìn)樣兩次。以峰面積（Area）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（mg）為橫坐標(biāo)，回歸計(jì)算各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)方程及其相關(guān)系數(shù)，計(jì)算大黃素、ω-羥基大黃素含量。

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)方法

挑取一環(huán)新鮮斜面菌種，接種于已經(jīng)高壓滅菌的裝有100 mL 種子培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，其中28℃，110 rpm 搖床培養(yǎng)96 h 作為種子；按10%的種子液（單菌加入10%的種子液，混合菌中兩株菌各加入5%），接種量將種子培養(yǎng)液接入裝有已經(jīng)高壓滅菌的大黃素25 mg、麩皮10 g，的500 mL 三角瓶中，于無(wú)菌操作條件下加入8 mL 水，用無(wú)菌鋼鏟充分?jǐn)嚢杈鶆颉Ｍ瑫r(shí)，按上述方法制備不接菌的大黃素培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，按上述方法制備接菌不加大黃素培養(yǎng)基作為菌株陰性空白對(duì)照，將待轉(zhuǎn)化樣品、空白對(duì)照品及菌株陰性空白對(duì)照放入生化培養(yǎng)箱或恒溫培養(yǎng)箱中，在28℃條件下培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化物由棕黃色變棕紅色，菌絲布滿整個(gè)轉(zhuǎn)化物表面及瓶底時(shí)，將三角燒瓶從恒溫培養(yǎng)箱中取出，培養(yǎng)時(shí)間為120 h。

1.6 薄層層析

將大黃素發(fā)酵提取物、標(biāo)準(zhǔn)品大黃素、ω-羥基大黃素點(diǎn)樣于硅膠板上，分別以大黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物展開劑乙酸乙酯：甲醇：甲酸（15∶1∶0.5），氯仿：甲醇：甲酸（9∶1∶0.5），環(huán)己烷：甲醇：甲酸（1∶1∶0.5）為展開劑展開，在365 nm紫外燈下檢視[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中大黃素、ω-羥基大黃素的含量測(cè)定。

按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得不同固態(tài)轉(zhuǎn)化的各樣品ω-羥基大黃素、大黃素的含量。計(jì)算公式[27]為大黃素投料量的折算值=大黃素投料量×（空白不加菌對(duì)照品的測(cè)得量/空白不加菌對(duì)照品的投料量）；ω-羥基大黃素的生成率=ω-羥基大黃素的量/大黃素投料量的折算值× 100%；大黃素的轉(zhuǎn)化率=（總大黃素量-剩余大黃素量）/大黃素投料量的折算值×100%。

用58 株菌對(duì)大黃素進(jìn)行固態(tài)轉(zhuǎn)化，有57 株已轉(zhuǎn)化大黃素，39 株能轉(zhuǎn)化生成ω-羥基大黃素，所以只對(duì)已轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物進(jìn)行分析。34 株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物ω-羥基大黃素生成率越大，大黃素轉(zhuǎn)化率也越大，5 株菌YIM39335、YIM3088、YIM3210、YIM3015 和 YZ3.62例外。

2.2 大黃素轉(zhuǎn)化率最高的7組混合菌與組成這7組混合菌的單菌比較

本實(shí)驗(yàn)是為了尋找大黃素轉(zhuǎn)化率高的菌株組合，并考察組合混合菌的各單菌之間是否存在協(xié)同作用，所以只對(duì)轉(zhuǎn)化率高的混合菌與組合混合菌的各單菌比較（表1、圖1）。

在29組混合菌固態(tài)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的大黃素轉(zhuǎn)化率最高的7 組混合菌分別為YIM321801:YIM3088、YIM321801:YIM3058、YZ3.41:YIM321812、YIM3234: YZ3.9015、YZ3.41: YZ3.72、8-66: YZ3.42、YIM3234: 8-66，其 轉(zhuǎn) 化 率 依 次 為 60.1%、34.7%、26.6%、22.7%、21.5%、20.3%、20.2%（表1）。

可以看出，菌株YIM321801 與菌株YIM3088 合用 ，菌株 YIM321801 與菌 株YIM3058 合用，菌株YZ3.41 與菌株 YIM321812 合用，菌株 YIM3234 與菌株YZ3.9015 合用，菌株 YZ3.41 與菌株 YZ3.72 合用，菌株YIM3234 與菌株8-66 合用，均能使大黃素轉(zhuǎn)化率增高，其中菌株YIM321801 與菌株YIM3088 合用效果最為顯著，大黃素轉(zhuǎn)化率達(dá)到60.1%，而單菌YIM321801大黃素轉(zhuǎn)化率僅為30.7%，單菌YIM3088 大黃素轉(zhuǎn)化率僅為21.1%。菌株YZ3.41 與菌株YZ3.72 合用效果較為顯著，大黃素轉(zhuǎn)化率達(dá)到21.5%，而單菌YZ3.41大黃素轉(zhuǎn)化率僅為9.1%，單菌YZ3.72 大黃素轉(zhuǎn)化率僅為8.2%。菌株YZ3.41 與菌株YIM321812 合用效果也較為顯著，大黃素轉(zhuǎn)化率達(dá)到26.6%，而單菌YZ3.41大黃素轉(zhuǎn)化率僅為9.1%，單菌YIM321812大黃素轉(zhuǎn)化率僅為19.1%。

2.3 ω-羥基大黃素生成率最高的8 組混合菌與組成這8組混合菌的單菌比較

為了尋找ω-羥基大黃素生成率高的菌株組合，并考察組合混合菌的各單菌之間是否存在協(xié)同作用，所以只對(duì)高ω-羥基大黃素生成率的混合菌與組合混合菌的各單菌比較，8 組混合菌與單菌固態(tài)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的ω-羥基大黃素生成率（表2、圖2）。

在29 組混合菌固態(tài)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的ω-羥基大黃素生成率最高的8 組混合菌分別為YIM321801:YIM3088、YIM321801:YIM3058、YZ3.41:YIM321812、YIM3234: YZ3.9015、YZ3.42: YZ3.9015、YIM3001:YIM39321、米根霉:YZ3.72、YZ3.41:YIM39321，其ω-羥基大黃素生成率依次為32.9%、22.4%、13.7%、12%、9.6%、9.2%、8.9%、8.5%（表2）。

可以看出，菌株YIM321801 與菌株YIM3088 合用 ，菌 株 YZ3.41 與 菌 株YIM321812 合 用 ，菌 株YIM3234 與菌株 YZ3.9015 合用，菌株 YIM3001 與菌株YIM39321 合用，菌株 YZ3.41 與菌株 YIM39321 合用，均能使ω-羥基大黃素生成率增高，其中菌株YIM321801 與菌株YIM3088 合用效果最為顯著，ω-羥基大黃素生成率達(dá)到32.9%。而單菌YIM321801ω-羥基大黃素生成率僅為22.8%，單菌YIM3088 大黃素轉(zhuǎn)化率僅為0.8%。菌株YIM3001與菌株YIM39321合用效果較為顯著，ω-羥基大黃素生成率達(dá)到9.2%，而單菌YIM3001ω-羥基大黃素生成率僅為1.1%，單菌YIM39321ω-羥基大黃素生成率僅為3.0%。菌株YZ3.41與菌株YIM321812合用效果較為顯著，ω-羥基大黃素生成率達(dá)到13.7%，而單菌YZ3.41ω-羥基大黃素生成率僅為7.1%，單菌YIM321812ω-羥基大黃素生成率僅為10.7%。

表1 7組混合菌與單菌固態(tài)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的大黃素轉(zhuǎn)化率

圖1 （Ⅰ、Ⅱ）混合菌與單菌固態(tài)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的大黃素轉(zhuǎn)化率比較

表2 8組混合菌與單菌固態(tài)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的ω-羥基大黃素生成率

圖2 （Ⅰ、Ⅱ）混合菌與單菌固態(tài)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的ω-羥基大黃素生成率比較

2.4 混合菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中ω-羥基大黃素生成率及大黃素轉(zhuǎn)化率最高的HPLC圖譜

2.5 菌株固態(tài)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的其他情況

產(chǎn)生成分種類最多的菌株分別是8-66，共有8 種未知成分（除ω-羥基大黃素外）。58 株菌中具有轉(zhuǎn)化能力的菌株有57 株，能轉(zhuǎn)化成ω-羥基大黃素的有39株。其中專一性較強(qiáng)（只產(chǎn)生1 種成分）的有YZ3.9022、YZ3.9024、YZ3.9021、YZ3.9023、YIM39439、YZ3.9032、YZ3.9034、YIM39409 共 8 株菌，其中菌株YIM39439 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物產(chǎn)生ω-羥基大黃素，生成率為0.4%，其余7 株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均沒(méi)有產(chǎn)生ω-羥基大黃素，其大黃素轉(zhuǎn)化率依次為5.5%、0.6%、2.5%、0.4%、0.6%、2.3%、1.0%、1.2%。

3 結(jié)論

本研究分別用單菌與混合菌固態(tài)轉(zhuǎn)化大黃素，并對(duì)大黃素的轉(zhuǎn)化率和ω-羥基大黃素的生成率進(jìn)行比較研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一些混合菌能提高ω-羥基大黃素生成率和大黃素轉(zhuǎn)化率。即組成混合菌的兩單菌間存在協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)3組協(xié)同作用非常顯著的混合菌YIM321801（青霉屬Penicillium）:YIM3088（臺(tái)灣根霉Rhizopus formosensis）、YIM321801（青霉屬Penicillium）:YIM3058（土 曲 霉 Aspergillus terreus）、YZ3.41（茄腐皮鐮刀 Fusarium solani）:YIM321812（毛霉屬M(fèi)ucor），轉(zhuǎn)化率依次為60.1%、34.7%、26.6%。其中最顯著的是YIM321801（青霉屬 Penicillium）:YIM3088（臺(tái)灣根霉Rhizopus formosensis），大黃素轉(zhuǎn)化率達(dá)到60.1%。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的ω-羥基大黃素的生成率最高的3 組混合菌分別為YIM321801:YIM3088，YIM321801:YIM3058 及 YZ3.41:YIM321812，其生成率依次為32.9%、22.4%、13.7%。

圖3 混合菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中ω-羥基大黃素生成率及大黃素轉(zhuǎn)化率最高的HPLC圖譜

生物轉(zhuǎn)化過(guò)程十分復(fù)雜，受多種因素的影響，實(shí)驗(yàn)中絕大多數(shù)混合菌比單菌大黃素轉(zhuǎn)化率和ω-羥基大黃素生成率高，即混合菌比單菌生物轉(zhuǎn)化大黃素強(qiáng)，各種菌株組合成的混合菌起到了協(xié)同作用。特別是功能弱的菌株組合后功能增強(qiáng)，起到協(xié)同作用。這可能是因?yàn)閱尉l(fā)酵時(shí)微生物的代謝產(chǎn)物大量積累阻礙相關(guān)酶類的合成，而混合菌發(fā)酵中各菌株大多可以起到生長(zhǎng)代謝協(xié)調(diào)作用，某些微生物如真菌能夠利用這些代謝產(chǎn)物，從而解除這種阻礙作用，促進(jìn)相關(guān)酶類的合成，使得實(shí)驗(yàn)中混合菌比單菌生物轉(zhuǎn)化大黃素具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

新型的固態(tài)發(fā)酵方式有利于條件的控制及擴(kuò)大規(guī)模生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條件簡(jiǎn)單，為以后的生產(chǎn)及生物轉(zhuǎn)化提供了可行性。一些混合菌生物轉(zhuǎn)化大黃素作用顯著，即組成的這些混合菌的單菌之間存在一定的協(xié)同作用，混合菌轉(zhuǎn)化大黃素使得大黃素得到了進(jìn)一步開發(fā)利用，為提高中藥材中大黃素微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)率提供一種選擇，為大黃素單菌與混合菌轉(zhuǎn)化奠定一定的數(shù)據(jù)支持與理論基礎(chǔ)，為大黃素及中藥材如大黃、何首烏、虎杖的炮制、生物代謝等微生物轉(zhuǎn)化提供了一種新的思路。